【正文】 同時(shí)感謝百忙之中抽時(shí)間對(duì)本文進(jìn)行審閱、評(píng)議和參加本人論文答辯的各位師長(zhǎng)！希望我的畢業(yè)論文為我的大學(xué)生活畫下一個(gè)完美的句號(hào)，謝謝！。參考文獻(xiàn)1 Ando H，Adachi M，Umeda K，et al．Purification and characterization of a novel transglutaminase derived from microorganism[J]． Agric Biol Chem．1989，53：2613～26172 周楠迪，陳堅(jiān)，鄭美英等． 谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的功能性質(zhì)及其在食品中的應(yīng)用方法[J]．中國(guó)食品添加劑．2000，1：54～583 柏映國(guó)，燕國(guó)梁．Streptomyces hygroscopicus　產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)．2004(2)：27~324 王璋，王灼維等．微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)菌的“神州四號(hào)”飛船搭載育種研究[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)．2004(1)：6～125 Gerber U，Jucknischke U，Putzien S，et al．A rapid and simple met hod for the purification of transglutaminase from Streptoverticillium mobaraense[J]．Biochem J．1994，299：825～829 6 常中義，江波等．微生谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用進(jìn)展[J]．食品科學(xué)．2002，21(9)：6～77 鄭美英，陳堅(jiān)等．谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶－理化性質(zhì)、生產(chǎn)方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]．生物工程進(jìn)程．2001，21，(1)：33～378 Y Zhu．Microbial transglutaminasea review of its production and　application infood processing[J]．Appl Micrbiol Biotechol．1995，44：277~2829 寇明鈺，趙國(guó)華，闞健全．谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶及其在食品工業(yè)中的作用[J]．中國(guó)食品添加劑．2004，5 ：81～8810 王穩(wěn)航．谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在畜產(chǎn)加工中的應(yīng)用[J]．肉類工業(yè)．2002，8：28～3111 梁海燕，馬儷珍．谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在肉制品加工中的應(yīng)用[J]．肉類研究．2004，1：50～5212 林加涵，魏文鈴等．現(xiàn)代生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（下冊(cè)）[M]．北京：高等教育出版社，2001： 36～4013 O’Sullivan M．M．，Lorenzen P．C．，O’Connell J．E．，et al．Short Communication：Influence of Transglutaminase on the Heat Stability of Milk，［J］．Dairy Sci．2001，84：1331～133414 O’Sullivan M．M．，Kelly A．L．，and Fox P．F．Effect of　Transglutaminase on the Heat Stabilit y of Milk：a Possible Mechanism，［J］．Dairy Sci．2002，85：1～715 程國(guó)華．生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］．沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998．11～1416 王灼維，王璋．土壤分離轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)菌株[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)．2004（4）：5～917 Suzuki S，Izawa Y，Kobayashi K，et al．Purification and characterization of novel transglutaminase from Bacillussubtilis spores[J]．Biosci Biotechnol Biochem．2000，64：2344～235118 何忠效．電泳[M]．北京：科學(xué)出版社．1999．129～139致　　謝感謝我的導(dǎo)師馬永強(qiáng)老師的指導(dǎo)，從選題、定題、方案的設(shè)計(jì)開始，一直到最后論文的反復(fù)修改、潤(rùn)色，馬老師始終認(rèn)真負(fù)責(zé)地給予我深刻而細(xì)致地指導(dǎo)，幫助我開拓研究思路，精心點(diǎn)撥、熱忱鼓勵(lì)。，～，得出該酶更適合在偏酸性或中性的環(huán)境，～Ca2+、Mg2+、Ba2+對(duì)MTG的活性幾乎沒有影響，而Fe3+、Zn2+ 、Cu2+抑制酶活，其中Fe3+對(duì)其活性的影響最大。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶經(jīng)SDSPAGE檢驗(yàn)蛋白純度，得到單一區(qū)帶，說明分離純化的效果較好，并得出的相對(duì)分子質(zhì)量為38 000左右。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶經(jīng)過超濾脫鹽及聚乙二醇濃縮后，%。由此可得出在該酶的實(shí)際應(yīng)用中，可盡量避免混入Fe3+，以及Zn2+ 和Cu2+，所使用的生產(chǎn)、儲(chǔ)藏以及輸送的設(shè)備應(yīng)該考慮使用不銹鋼材料，避免使用鐵質(zhì)材料，以發(fā)揮酶的最大活性。綜合酶的最適pH和pH穩(wěn)定性可知，該酶比較適合偏酸性的環(huán)境，將pH跳到6～7時(shí)，有助于酶發(fā)揮其活性和保證其穩(wěn)定性。 酶的最適pH和pH穩(wěn)定性由圖39所示，在pH6左右該酶具有最大活力，當(dāng)再將pH調(diào)高一些達(dá)到7時(shí)，對(duì)活性的影響不大。由圖38所示，在溫度范圍35℃～45℃之間較為穩(wěn)定，酶活性隨著溫度降低的速率比隨溫度上升的速率要慢，可知當(dāng)溫度升高時(shí)，酶活性下降的速率較快。通過SepharoseG100柱層析能進(jìn)一步排除絕大部分雜蛋白，使樣品得以進(jìn)一步純化，效果較好。表31 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶分離純化結(jié)果純化步驟總酶活/U總蛋白/mg比活力/Umg1純化倍數(shù)回收率/%粗酶1100硫酸銨鹽析超濾濃縮凝膠層析由表31可見，粗提液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀后，這個(gè)結(jié)果證實(shí)55%硫酸按飽和度分級(jí)沉淀對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的初步純化有較好的效果，可以去除部分雜蛋白，而最大限度地保留酶蛋白。經(jīng)過電泳后，粗酶存在多個(gè)條帶，并且條帶并不清晰，說明所購買的粗酶中還存在其他的雜蛋白，純化后的酶液有一條單一區(qū)帶，與相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶相對(duì)分子質(zhì)量約為38 000， SDSPAGE試驗(yàn)證明，本試驗(yàn)所采用的純化工藝對(duì)純化谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶效果比較理想，最終獲得純度較高的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。實(shí)驗(yàn)中收集第6078管的酶液合并，作為下一步實(shí)驗(yàn)的供試液。當(dāng)酶活性在72管中達(dá)到最高峰后，其活性的下降速率較快，分析其原因可能是由于其變性所導(dǎo)致的。其中洗脫液中酶活性最高的位于第72管，在7281管之間時(shí)，洗脫液中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性隨洗脫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低；此后收集的洗脫液中基本不含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，蛋白質(zhì)含量也隨洗脫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。由于在前42管中所測(cè)得的蛋白含量和酶的活力都非常的小，并沒有太大的實(shí)際意義，所以在這里只繪出了第42管至第96管的層析曲線。圖34 超濾壓強(qiáng)與相對(duì)酶活關(guān)系 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶凝膠過濾柱層析曲線在100支試管中分別得到1mL的溶液，每間隔2個(gè)試管，測(cè)管中的蛋白含量和酶活力，以洗脫時(shí)間為橫坐標(biāo)，得到凝膠過濾柱層析曲線如圖34所示。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶超濾結(jié)果做出關(guān)于超濾壓強(qiáng)與相對(duì)酶活關(guān)系的曲線，如圖34所示，酶的活性隨壓強(qiáng)的提高而提高，酶活性有所下降。而硫酸銨的飽和度在75%以上時(shí)，沉淀酶活性不再增加，反而略有下降，故可認(rèn)為此時(shí)以將酶蛋白沉淀完全。3 結(jié)果與討論 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線L谷氨酸γ單羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖31所示，得到的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=+（R2=）y：525nm下的吸光值x：濃度（mmol /mL）圖31 L谷氨酸γ單羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線考馬斯亮藍(lán)G－250測(cè)定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖32所示，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=+， R2=y：595nm下的吸光值x：蛋白質(zhì)含量（μg/mL）圖32 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶硫酸銨分級(jí)沉淀鹽析曲線測(cè)定6組上清液及沉淀中的酶活力，并以未加硫酸銨的粗酶液中的酶活力為100%，計(jì)算不同飽和度下上清液及沉淀中的酶相對(duì)活力，以硫酸銨的飽和度為橫坐標(biāo)，酶相對(duì)活力為縱坐標(biāo)繪制鹽析曲線，從而得到如圖32所示。于525nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光值，并計(jì)算其酶活力。 金屬離子對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活力的影響取出七支具塞試管，分別加入10mL酶液，然后向其中六支試管中分別加入CaCl2，MgCl2，F(xiàn)eCl3，ZnCl2，BaCl2，CuCl2六種鹽酸鹽溶液，最后一支作為空白對(duì)照，將這七只試管在室溫放置120min。、。 pH對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶穩(wěn)定性的影響，加入已經(jīng)預(yù)熱至37℃的1mL酶液，室溫放置120min，吸取上述溶液1mL于具塞試管中，再加入已經(jīng)預(yù)熱至37℃的2mLA試劑，于37℃水浴反應(yīng)10min