【正文】 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 27 頁 共 29 頁 參考文獻(xiàn) 1 李洪淼 .植酸酶畢赤酵母基因工程菌 [D] .四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文， 2020,6 月 2 李曉龍 , 楊合同 , 吳遠(yuǎn)征 , 等 . 植酸酶的多樣性及其分類 [J] . 農(nóng)產(chǎn)食品科技 , 2020,5 月 3 杜麗敏 , 段相林 . 植酸酶的來源與應(yīng)用 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科技 , 2020, 8 月 4 施安輝 , 王光玉 . 目前國內(nèi)外植酸酶研究進(jìn)展 [ J] . 中國釀造 , 2020( 5) : 5~ 10. 5 李秀娟 , 尹玲 , 李秀珍 , 黃賢剛 . 植酸酶 畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J] . 2020, 5 月 6 汪世華 , 呂茂洲 , 孫長春 , 等 . 植酸酶的現(xiàn)狀及其研究進(jìn)展 . 2020, 9 月 7 楊燕凌 , 沙莉 , 方金銅 . 微生物植酸酶的研究與應(yīng)用 . 武夷科學(xué) , 2020, 23: 191195 8 郭會燦 , 杜娜 . 植酸酶在工業(yè)中的應(yīng)用 . 河北工業(yè) , 2020, 31(11): 1011 9 葉冰 , 王運(yùn)吉 , 張苓花 . 植酸酶畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵 . 大連輕工業(yè)學(xué)報(bào) , 2020, 21(3): 193196 10 周德慶 . 微生物學(xué)教程 . 第 2 版 . 北京：高 等教育出版社 , 2020: 159160 11 M. HASSLACHER, M. Schall, M. HAYN, et al. Highlevel Intracellular Expression of Hydroxyl nitrile Lyase from the Tropical Rubber Tree Hevea Brasiliensis in Microbial Hosts. Protein Expres Purif, 1997, 11(1): 6171 12 A. S. XIONG, Q. H. YAO, R. H. PENG, et al. Highlevel Expression of a Synthetic Gene Encoding Peniophora Lycii Phytase in Methylotrophic Yeast Pichia Microbiol Biotechnol, 2020, 72(5): 10391047 13 K. SANO, H. FUKUHARA, Y. NAKAMURA. Phytase of the Yast Arxula Adeninivorans. Biotec hnol. Lett, 1999, 21: 3338 14 T. R. SHIEH, J. H. WARE. Survey of Microanisms for the Production of Extracellular Phytase. Appl. Microbiol, 1968, 169(9): 13481351 15 C. LAMBRECHTS, H. BOZE, G. MOULIN, et al. Utilization of Phytase by Some Yeast. Biotechnol. Lett, 1992, 14(1): 6366 16 A. VOHRA, T. SATYANARAYANA. Statistial Optimization of the Medium 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 28 頁 共 29 頁 Components by Response Surface Methodology to Enhance Phytase Production by Pichia Biochem, 2020, 37: 9991004 。 發(fā)酵產(chǎn)植酸酶過程中的影響因素研究及其發(fā)酵條件的優(yōu)化 通過對畢赤酵母工程菌發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵罐培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過程影響因素的研究，將發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，使發(fā)酵產(chǎn)的植酸酶的酶活性得到了很大的提升。發(fā)酵完畢后最終的植酸酶酶活性達(dá)到了 31985U/mL 發(fā)酵液。發(fā)酵罐發(fā)酵的生長階段培養(yǎng)基最適 pH 值為 ，發(fā)酵罐發(fā)酵的誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基最適 pH 值為 ，搖瓶培養(yǎng)畢赤酵母條件與這些不同。最終酶活達(dá)到 25365U/mL 發(fā)酵液。 因此，誘導(dǎo)時間使用混合碳源縮短了 12 小時發(fā)酵周期，繼續(xù)縮短了 6 小時。 誘導(dǎo)時間 發(fā)酵階段的誘導(dǎo)時間，從加入碳源誘導(dǎo)每 6h 植酸酶活性測定，結(jié)果如圖 213 所示 051015202530350 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72誘導(dǎo)時間（ h ）酶活力（KU/mL） 圖 213 誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶的影響 The effect of induction time on the production of phytase 圖 213 顯示了前 54 小時，迅速合成大量的植酸酶 ，酶活性增加， 54 h 酶的活性不再上升。 綜合工程菌搖瓶培養(yǎng)階段的最適 pH 發(fā)酵階段的最適 pH 值，發(fā)現(xiàn)無論是搖瓶或發(fā)酵，最適生長 pH 值與最佳產(chǎn)酶 pH 值不相同，搖瓶和發(fā)酵罐之間也有差異。 182022245. 0 5. 5 6. 0 6. 5 7. 0培養(yǎng)基 pH菌體濃度（OD600）26272829303132酶活（KU/mL）菌體濃度 酶活 圖 212 誘導(dǎo)階段 pH 對菌體濃度和產(chǎn)酶的影響 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 24 頁 共 29 頁 The effect of pH on yeast concentration and the production of phytase at inducing phase 圖 212 顯示， pH 值 至 范圍內(nèi)，植酸酶酶活性隨 pH 值的增加而增加，活性達(dá)到最大是在 pH 時， pH 值超過 ，植酸酶酶活性降低。 誘導(dǎo)階段 pH 研究的畢赤酵母發(fā)酵罐培養(yǎng)基 pH 值對細(xì)胞的生長和產(chǎn)酶的影響， pH 值取, 五個，培養(yǎng) 2h，每過 4 小時測定細(xì)胞濃度，山梨糖醇 甲醇混合碳源誘導(dǎo) 60h 后 ，測定的活性測定。成長階段是獲得活力細(xì)菌，生物量積累為主要目，誘導(dǎo)期再調(diào)整 pH 值，以得到最大活性。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 23 頁 共 29 頁 23242526272829酶活（ K U / m L ）5. 0 5. 5 6. 0 6. 5生長階段培養(yǎng)基 pH 圖 212 生長階段 pH 對產(chǎn)酶的影響 The effect of pH on the production of phytase at growth phase 圖 212 可以看到 植酸酶活性隨 pH 值的增加呈上升的趨勢，酶的活性最高是當(dāng)培養(yǎng)基的 pH 值 時。 01234567892 6 10 14 18 22培養(yǎng)時間（ h ）菌體濃度（OD600）p H 5 . 0 p H 5 . 5 p H 6 . 0 p H 6 . 5 圖 211 生長階段 pH 對菌體濃度的影響 The effect of pH on yeast concentration at growth phase 從圖 211 可以看出，在發(fā)酵罐的菌體生長階段， pH 值 時，菌體濃度最高，再者就是 pH 為 ，當(dāng) pH 值 ，細(xì)胞濃度最小，所以我們可以看到，過低的 pH 值是不利于細(xì)菌的生長。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 22 頁 共 29 頁 生長階段 pH 研究發(fā)酵罐培養(yǎng)基 pH 值對畢赤酵母的細(xì)胞的生長和產(chǎn)酶的影響， pH 值取, ，培養(yǎng)兩小時后，每 4h 測定細(xì)胞濃度，用山梨醇 甲醇混合碳源誘導(dǎo)60h 后對活性測定。有助于減少誘導(dǎo)時間，醇氧化酶（ AOX1）基因啟動子調(diào)控植酸酶的表達(dá)，因此植酸酶的表達(dá)量也增加。使用山梨醇 甲醇混合碳源時在 60h 活性最大，為25365U/mL。 036912151821240 12 24 36 48 60 72 84 96誘導(dǎo)時間（ h ）酶活（KU/mL） 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 21 頁 共 29 頁 圖 29 甲醇單一碳源誘導(dǎo)曲線 Induction curve of useing methanol as single carbon source 03691215182124270 12 24 36 48 60 72 84 96誘導(dǎo)時間（ h ）酶活（KU/mL） 圖 210 山梨醇 甲醇混合碳源誘導(dǎo)曲線 Induction curve of useing sorbitol methanol mixed carbon sources 由圖 29 和圖 210 的結(jié)果顯示，最初的 12 小時酶活性增加非常緩慢，因?yàn)楣こ叹€未適應(yīng)甲醇環(huán)境，工程菌誘導(dǎo)后 12 小時后，已適應(yīng)甲醇的環(huán)境，并 開始產(chǎn)生植酸酶，酶活先快后慢，最終穩(wěn)定下來，活性不再增加。 這項(xiàng)研究是甲醇唯一碳源和山梨醇 甲醇混合碳源誘導(dǎo)工程菌，混合碳源 25％山梨醇與 100％的甲醇的比例為 1:6。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 20 頁 共 29 頁 20212223242526酶活（ K U / m L ）對照 1 ∶ 8 1 ∶ 6 1 ∶ 4 1 ∶ 2山梨醇與甲醇之比 圖 28 山梨醇 甲醇混合碳源對產(chǎn)酶的影響 The effect of sorbitolmethanol mixed carbon sources on the production of phytase 我們可以從圖 28 中看到的結(jié)果，與對照組酶的活性相比，添加山梨糖醇后酶的活性較高，山梨醇和甲醇比為 1:6 時，酶的活性增加 ％。 25％的山梨醇和 100％甲醇比為 1:8,1:6,1:4,1:2 對照組不添加甲醇。因此 ，甲醇選擇加入 ， 12 小時的額外添加時間。從時間間隔來看，額外添加甲醇的時間間隔 12h 明顯比間隔 24 小時要好。 在圖 27 所示，時間間隔與甲醇量對酶的活性的影響。然而，當(dāng)甲醇濃度過高，會抑制細(xì)胞生長。 在誘導(dǎo)期，甲醇作為唯一碳源對細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)酶提供能量。當(dāng) 甲醇用量 毫升 /天到 ，無論間隔 12 h 或間隔 24 h 額外添加甲醇，細(xì)胞濃度增加與甲醇量的增加成正比，但甲醇增加到大于 毫升 /天時，細(xì)