外源基因在畢赤酵母中表達(dá)水平的預(yù)測(參考版)
2025-05-02 12:37本頁面
【正文】 PRDM1 JMJD2B ZC3HAV1 EDD KLF9 ZCHC7 FBXL11 ZDHHC18 ZNF513 MARH6 ZNF92 ZNF555 NR1D2 ZNF277 ZNF638 FUS ZNF292 ZNF740 SHPRH ZNF312 ZNF597 S2A4R ZNF395 ZNF610 TNAP3 ZNF505 ZNF642 WHSC1 ZNF553 ZNF652 NU153 NR4A2 Centauringamma2 。 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組運(yùn)用 RNAi技術(shù)分別下調(diào) Fascin和 Ezrin基因在食管癌細(xì)胞中的表達(dá) ，可顯著降低食管癌細(xì)胞的分裂增殖與侵襲移動 ，說明這兩個基因是新的食管癌相關(guān)基因，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演著十分重要的角色。 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 預(yù)期 SDSPAGE結(jié)果： 經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后脫色 Marker 樣品 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 預(yù)期蛋白印跡結(jié)果 由畢赤酵母表達(dá)的NGAL蛋白 分子量 25K Da 由大腸桿菌表達(dá)的 NGAL蛋白分子量 21K D a 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 第三部分：分析其他目的基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率 實驗設(shè)計 1. 實驗?zāi)康模河卯叧嘟湍副磉_(dá)以下目的基因，如 Fascin， Ezrin，鋅指蛋白（見下頁）； 2. 預(yù)測這些基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率； 3. 如果這些基因被預(yù)測為低表達(dá)，該如何處理； 4. 由于生成的重組蛋白要求切除信號肽，在選擇多克隆位點和設(shè)計 PCR引物時應(yīng)注意什么問題； 5. 檢驗載體與酵母染色體的不同重組對外源蛋白表達(dá)量的影響； 6. 檢驗不同培養(yǎng)條件對外源蛋白表達(dá)量的影響 。l液體）加到保鮮膜上； ? 從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，室溫下孵育 2h； ? 用 PBST在室溫下脫色搖床上漂洗兩次，每次 5min，再用 PBS漂洗一次， 5min； ? 二抗（山羊抗大鼠 IgG HRP）用封閉液 1： 2022稀釋并與膜蛋白面接觸（每張膜 500181。l ? 上樣時要記清上樣的順序 ? 微量注射器不可過低 ,以防刺破膠體；也不可過高 , 樣品下沉?xí)r易發(fā)生擴(kuò)散，溢出加樣孔 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 10. 接通電源， 100V恒壓電泳，至溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約 ～ 1cm時，約 ，停止電泳 ； 11. 凝膠的處理： ? 剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，剝膠時要小心 ,保持分離膠完好無損 ,將分離膠做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入考馬斯亮藍(lán)染色染色液，染色約 4h；染色后的凝膠板用脫色液脫色 ，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。l + 5 上樣 buffer 5181。 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 7. 拔出樣梳后 ,拆掉密封條，在內(nèi)槽中加入緩沖液； 8. 上樣： ? marker 5 181。注膠過程 最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡； ? 水封的目的：保持分離膠上沿平直，排氣泡； ? 膠凝好的標(biāo)志：膠與水層之間形成清晰的界面； 6. 倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入縮膠至離邊緣5mm處，迅速插入梳子，靜置到膠凝固。l 5 181。l 25 181。l 50 181。 由大腸桿菌表達(dá)獲得的 NGAL蛋白 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 實驗步驟 ? 獲得含目的蛋白的酵母上清 ? SDSPAGE電泳 ? 蛋白質(zhì)印跡 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行NGAL蛋白外源表達(dá)進(jìn)行驗證的實驗技術(shù)路線： 構(gòu)建表達(dá)載體 → 轉(zhuǎn)化至酵母菌中 → 篩選陽性轉(zhuǎn)化單克隆 → 篩選高表達(dá)單克隆 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 挑單克隆于培養(yǎng)液 振蕩培養(yǎng) 3～ 5天，加甲醇誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá) 離心 酵母上清 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 1. 將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干 , 準(zhǔn)備 2個干凈的小燒杯； 2. 把玻璃板在灌膠支架上固定好，放好密封條和隔離板 , 固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板 。 NGAL基因的簡介 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! NGAL核酸編碼區(qū)序列及其相應(yīng)的蛋白序列： 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! ? 由 N 端的 310螺旋、 C 端的 α螺旋和中間的八
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