外源基因的表達(dá)ppt課件(參考版)
2025-01-20 17:10本頁面
【正文】 ?外源基因融合表達(dá)。 外源目的基因在藍(lán)藻細(xì)胞中的表達(dá) 在藍(lán)藻細(xì)胞中高效表達(dá)外源目的基因的策略 ?構(gòu)建在藍(lán)藻細(xì)胞中穩(wěn)定性好的表達(dá)載體系統(tǒng)。 藍(lán)藻在各生長時期均處于感受狀態(tài) ，均可用于轉(zhuǎn)化，但通常采用對數(shù)生長中期到后期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 ?多種藍(lán)藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍(lán)藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件。 ?細(xì)胞壁屬 G－ ，主要由肽聚糖組成，便于外源DNA的轉(zhuǎn)化。 藍(lán)藻與真核生物藻類最大的區(qū)別是： 它無葉綠體，無真核，有 70S核糖體，細(xì)胞壁中含有肽聚糖，因而對青霉素和溶菌酶十分敏感等。 主要有 ?變鉛青鏈霉菌作為外源基因表達(dá)的受體細(xì)胞所具有的優(yōu)點： ?遺傳背景清楚，不含內(nèi)源性質(zhì)粒； ?對外源 DNA無明顯的修飾作用； ?能高效表達(dá)鏈霉菌基因以外的其它基因； ?具有高效的異源蛋白分泌系統(tǒng)，并且其內(nèi)源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。 ?密碼子的 第三位堿基 具有明顯的選擇性，一般 C的頻率明顯高于 G的頻率 。 ?編碼蛋白質(zhì)的堿基序列中 GC的平均含量高達(dá) 73％，密碼子的第一、第二和第三位堿基的 GC含量分別達(dá) 66％、 53％和 93％，而該現(xiàn)象不存在于非編碼區(qū)。 ?終止子 具有較長的不完全互補(bǔ)反向重復(fù)序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。 ?鏈霉菌作為外源基因表達(dá)的受體細(xì)胞所具有的特點： ?為非致病性細(xì)菌，不產(chǎn)生內(nèi)毒素； ?可進(jìn)行外源蛋白的分泌表達(dá)； ?可進(jìn)行高密度培養(yǎng)，具有豐富的次級代謝途徑和初、次級代謝調(diào)控體系，表達(dá)外源蛋白的時間較長； ?鏈霉菌在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用歷史悠久，有良好的工業(yè)化基礎(chǔ)。 宿主菌 常用的宿主菌 枯草芽孢桿菌 短小芽孢桿菌 地衣芽孢桿菌 外源基因在芽孢桿菌中的分泌表達(dá) 芽孢桿菌的細(xì)胞膜不同與大腸桿菌，通常只有一層細(xì)胞膜 ，當(dāng)分泌型蛋白質(zhì)跨膜后就進(jìn)入到培養(yǎng)基中，因此，外源蛋白的表達(dá)量可以達(dá)到很高的水平，其表達(dá)量可達(dá) 30g/L。 整合質(zhì)粒： 在大腸桿菌質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建而成，不含在芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)制的起始序列，因而不能在芽孢桿菌中自主復(fù)制，但它能 插入到宿主染色體 并將外源基因和標(biāo)記基因整合到染色體上，隨細(xì)胞染色體復(fù)制而復(fù)制，該方式表達(dá)外源基因解決了芽孢桿菌中質(zhì)粒不能穩(wěn)定遺傳的問題。 芽孢桿菌啟動子的表達(dá)具有明顯的 時序性 ，它與菌體的生長周期和生理代謝活動密切相關(guān)。 短小芽孢桿菌型復(fù)制子的質(zhì)粒表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中的 拷貝數(shù)較低，但能穩(wěn)定 存在于宿主細(xì)胞中，甚至在沒有抗生素選擇壓力下也不易造成質(zhì)粒的丟失。 ?利用芽孢桿菌作為表達(dá)外源基因的受體菌的優(yōu)點： ?許多芽孢桿菌是非致病性微生物，培養(yǎng)條件簡單，生長迅速； ?表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，且多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物具有天然構(gòu)相和生物學(xué)活性； ?某些芽孢桿菌的遺傳背景比較清楚，便于進(jìn)行遺傳操作； ?利用芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵的技術(shù)相當(dāng)成熟。 二、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 芽孢桿菌 —— 屬 革蘭氏陽性菌 ，細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，能將表達(dá)蛋白分泌到細(xì)胞外。 ?提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。 ?提高稀有密碼子 tRNA的表達(dá)作用。甚至有些在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時無活性的蛋白質(zhì)分泌后則有活性。 缺點： 外源蛋白分泌型表達(dá)通常產(chǎn)量不高，有時信號肽不被切割或在不適當(dāng)?shù)奈恢冒l(fā)生切割。 ② 分泌到細(xì)胞外周質(zhì)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物較穩(wěn)定，不易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶所降解。信號肽 N端的最初幾個氨基酸為極性氨基酸，中間和后部為疏水氨基酸，它們對蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞膜外起決定性作用。 ⑤ 分泌型外源蛋白 外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，通過運輸或分泌的方式穿過細(xì)胞的外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中，即為 分泌型外源蛋白 。 ?當(dāng)外源基因被交換到染色體上后，由于宿主菌的不斷分裂和增殖，細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒逐漸被稀釋直至消失。此外，還必須將可控的表達(dá)元件和選擇標(biāo)記基因連接在一起。 外源基因 多分子線性重組 的方式通常有三種： ④ 整合型外源蛋白 為防止外源基因隨質(zhì)粒丟失，將要表達(dá)的外源基因整合到染色體的 非必需編碼區(qū) 上，使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分而穩(wěn)定地遺傳，以此種方式表達(dá)的外源蛋白即為 整合型外源蛋白 。 多編碼序列重組： 將多個外源基因串連在一起，利用 同一套 轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件、翻譯起始與終止密碼子，在各編碼序列的接口引入蛋白酶酶切位點或可被化學(xué)斷裂的位點。 多順反子重組： 多拷貝外源基因有各自的 SD序列、翻譯起始和終止信號，但轉(zhuǎn)錄是在 共同的轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子控制下進(jìn)行的，表達(dá)的外源蛋白分子是相互獨立的。表達(dá)的外源蛋白不需經(jīng)過裂解處理。 ③ 寡聚型外源蛋白 為提高外源蛋白表達(dá)量，在構(gòu)建外源蛋白表達(dá)載體時，將多個外源目的蛋白基因串連在一起，克隆在質(zhì)粒載體上，以這種方式表達(dá)的外源蛋白稱為 寡聚型外源蛋白 。 ② 融合蛋白 融合蛋白 —— 將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因的閱讀框，以這種方式表達(dá)的蛋白稱為融合蛋白。 以包涵體形式表達(dá)的外源蛋白最突出的優(yōu)點是： 易于分離純化。 ：包括 DNA、 RNA和脂多糖等。 包涵體存在部位： 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì) 包
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