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β-半乳糖苷酶_酶活性_酶的固定化畢業(yè)論文(參考版)

2024-09-05 16:23本頁(yè)面
  

【正文】 擴(kuò)散阻力 固定化酶的反應(yīng) 體系和液體酶不同,即底物必須從。 微環(huán)境效應(yīng) (即分配效應(yīng) ) 微環(huán)境是指固定化酶附近的環(huán)境區(qū)域,而主體溶液則稱為大環(huán)境 , 反應(yīng)系統(tǒng)東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 31 中由于載體和底物的疏水性,親水性以及靜電作用,引起微環(huán)境和大環(huán)境之間不同的性質(zhì),這樣就形成了分配效應(yīng)。 固定化酶對(duì)反應(yīng)體系的影響 液體酶和固定化酶的基質(zhì) (S)和酶 (E)在反應(yīng)前的分布,如模擬圖 481: 圖 481 反應(yīng)開始前酶分子周圍基質(zhì)的分布 對(duì)液體酶反應(yīng),當(dāng)酶濃度為 102M 時(shí),酶與基質(zhì)問最大平均距離為 200A,對(duì)于固定化酶反應(yīng),若固定化酶顆粒直徑為 時(shí),則與粒子距離最近的基質(zhì)與載體中心的酶的距離為 ,為液體酶的 1000 倍,因此固定化酶反應(yīng)的物質(zhì)傳遞對(duì)反應(yīng)速度的影響變得更為重要了。 02040608010030 35 40 45 50 55 60溫度℃相對(duì)酶活% 圖 472 固定化酶的最適溫度 固定化酶的催化反應(yīng)機(jī)理探討 固定化酶反應(yīng)體系屬非均相催化反應(yīng)。 0204060801001203 4 5 6 7 8 9pH相對(duì)酶活% 圖 471 固定化酶 的最適 pH 固定化酶的最適溫度 取兩支試管,均加入 5mL ONPG 底物溶液,一支加入游離酶 ,一支加入 固定化酶,在不同溫度 (30℃ , 35℃ , 40℃ , 45℃ , 50℃ , 55℃ , 60℃ )下反應(yīng) 10min 滅活,測(cè)吸光值, 計(jì)算相對(duì)酶活, 結(jié) 果見圖 472。 由圖可知,固定化酶的最適 pH 在 6~7,在其范圍內(nèi)固 定化酶能保持游離酶活性的 80%左右 。因此,確定最適戊二醛濃度為 %。戊二醛作為一種雙功能交聯(lián)劑,可以使海藻酸鈉分子發(fā)生交聯(lián), 同時(shí)也可使酶交聯(lián)在載體上,強(qiáng)化海藻酸鈉的機(jī)械強(qiáng)度和固定化酶的穩(wěn)定性 [16]。 00 1 2 3固定化時(shí)間吸光值 圖 463 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶酶活的影響 戊二醛交聯(lián)試驗(yàn) 海藻酸鈉凝膠法雖操作方便,但凝膠網(wǎng)格大,且凝膠鈣化過程鈣離子從凝膠外部逐漸向內(nèi)擴(kuò)散,在凝膠顆粒中鈣離子分布不均勻,致使凝膠內(nèi)軟外硬,強(qiáng)度不夠,包埋不緊密,固化酶易破碎,大部分酶隨著批次轉(zhuǎn)化從凝膠的網(wǎng)格中或從第 4 章 酶的固定化 28 破碎處泄漏流失,因而酶活隨之急劇下降,操作穩(wěn)定性差,半衰期短。結(jié)果見圖 463???以看出 l% CaCl2濃度固定化酶的酶活高些,確定為最適濃度。且不易操作,很難將酶液從注射器中擠出,綜合各種因素,確定海藻酸鈉濃度為 4%,酶液與海藻酸鈉的體積比為 l: l(海藻酸鈉實(shí)際濃度為 2% )。將固定化酶加入 5mL ONPG 底物溶液中( 37℃ 預(yù)熱),反應(yīng) 10min 后加入 2mL Na2CO3 溶液中止反應(yīng),在離心機(jī)中以 120/rnin 離心2~3min,取上清液在 420nm 下測(cè)定吸光值,結(jié)果見圖 461。 第 4 章 酶的固定化 26 固定化的最適條件 海藻酸鈉濃度的確定 分別配制濃度為 1%, 2%, 3%。 β半乳糖苷酶固定方法 將一定濃度海藻酸鈉與酶液按 l: l 比例混合,吸入 7 號(hào)注射器內(nèi),再逐滴滴入氯化鈣溶液中,即成規(guī)則球形,球體在一定范圍內(nèi)不受滴落高度、速度及接觸溶液濃度的影響 ,操作完畢后,放入 4℃ 冰箱中硬化 2h,過濾洗滌,加入戊二醇溶液交聯(lián) 4h,洗滌,抽濾 3 次,測(cè)定酶活力。 β半 乳糖苷酶的固定 包埋材料選擇 包埋材料有瓊脂、瓊脂糖、 k卡拉膠、明膠、海藻酸鈉、聚丙烯酰胺、纖維素等,其中海藻酸鈉包埋法簡(jiǎn)單、無(wú)毒、安全、價(jià)格低廉,材料易得,是最常用的方法。該來(lái)源的酶具有水解牛奶中乳糖特點(diǎn)。 孫淑芳等人 (1999)將 β半乳糖苷酶固定在 D202 載體上,用戊二醛作交聯(lián)劑,與游離酶相比具有更寬的 pH 范圍。與游離酶相東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 25 比具有更寬的 pH 值范圍和更好的熱穩(wěn)定性。 李文英等人 (1990)對(duì)利用不同載體,不同方法固定化的 β半乳糖苷酶活力進(jìn)行了比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聚丙烯酰胺凝膠包埋活力回收率高。該系統(tǒng)連續(xù)反應(yīng) 6 周,總酶的活性下降不明顯,在 10℃ 下反應(yīng),可減少微生物的污染 [15]。每日循環(huán)一次, 20 小時(shí)進(jìn)行水解, 4 小時(shí)用于清洗。采用 Coming Glass Systerm 用鹽酸把經(jīng)巴氏滅菌的待處理液調(diào) pH 值為,通過酶反應(yīng) 器反應(yīng)約 15min,最初反應(yīng)溫度為 37℃ ,逐漸升高到 60℃ ,以補(bǔ)償酶活力的損失。 Peterson,等將來(lái)源于米曲霉的乳糖酶固定在由聚氯乙烯和硅膠組成的毛細(xì)管填充床上,在 30℃ ,停留時(shí)間 7min, 80%的脫脂乳能被水解。在半連續(xù)反應(yīng)器中循環(huán) 25 次以上,水解率能夠維持在 80%以上。固定化酶的半衰期是 180 天,而游離酶僅為 24天。 Papayannokos 和 Markas(1993)將黑曲霉來(lái)源的 β半乳糖苷酶通過吸附和分子內(nèi)交聯(lián)固定在多孔陶瓷上,固定化后沒有酶脫落現(xiàn)象。 Saito 和 Yoshida(1994)用多孔陶瓷作載體固定 β半乳糖苷酶,固定化酶 70℃處理 3 小時(shí),活力沒有下降。Bodalo 等人對(duì)不同固定化 β半乳糖苷酶進(jìn)行了比較,他們所選用的固定化方法有:多孔玻璃共價(jià)結(jié)合法、 GCP醛交聯(lián)法、 GCP芳香胺交聯(lián) 法、凝膠包埋法以及物理吸附法等。在生產(chǎn)中,必須根據(jù)具體情況,針對(duì)系統(tǒng)的特點(diǎn),選擇使東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 23 用適合的反應(yīng)器。其缺點(diǎn)是制作成本高,膜容易堵塞。操作時(shí),底物流經(jīng)纖維外表面,并擴(kuò)散進(jìn)入纖維內(nèi)腔,再在腔內(nèi)發(fā)生酶促反應(yīng),生成的反應(yīng)產(chǎn)物又?jǐn)U散返回流動(dòng)主體。在這種反應(yīng)器中,酶與中空纖維可按不同的方式安排。 圖 433 流化床反應(yīng)器 中空纖維反應(yīng)器 (Hollow Fiber Reactor) 中空纖維反應(yīng)器是把酶結(jié)合于半透性的中空纖維,這種中空纖維的半透膜,只允許底物和產(chǎn)物等小分子量的物質(zhì)通過,而分子量較大的酶則不能 ,如圖 434所示 。流化床反應(yīng)器具有傳熱與傳質(zhì)特性好、不堵塞、壓降較小等優(yōu)點(diǎn),也很適合排氣供氣的反應(yīng),但它需要較高的流速才能維持粒子的充分流態(tài)化,故放大較困難。 圖 432 定床反應(yīng)器 第 4 章 酶的固定化 22 流化床反應(yīng)器 (Fluidzed Bed Reactor, FBR) 流化床反應(yīng)器是一種裝有較小顆粒的垂直塔式反應(yīng)器 ,如圖 433 所示 。缺點(diǎn)是溫度和pH 值難控制;底物和產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生軸向分布,易引起相應(yīng)的酶失活程度也呈軸向分布;更換部分催化劑相當(dāng)麻煩;柱內(nèi)壓降相當(dāng)大,底物必須加壓后才能進(jìn)入。這是一種使用的最廣泛的固定化酶反應(yīng)器。適合于有底物抑制的催化反應(yīng)。在 CSTR 的液體出口處設(shè)置過濾器,可以把固定化顆粒保存在反應(yīng)器內(nèi),或直接選用磁性固定化酶,借助磁場(chǎng)吸力固定。具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、溫度和 pH 值容易控制、能處理膠體底物和不溶性底物及催化劑更換方便等優(yōu)點(diǎn),因而常被用于飲料和食品加工工業(yè)。根據(jù)酶的特殊性和應(yīng)用目的 (如工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)應(yīng)用或是生物學(xué)模型系統(tǒng) ),可以從許多方法中選擇。 雖然固定化方法及固定化載體較多,并用于多種酶,但是迄今為止,幾乎沒有一種固定化技術(shù)或載體能普遍適 用于每一種酶,因?yàn)楦鞣N酶的化學(xué)特性和組成差別很大,底物和產(chǎn)物性質(zhì)不同,產(chǎn)物的用途也不一樣。最常用的交聯(lián)試劑是戊二醛。 吸附法 通過非特異性物理吸附法或生物物質(zhì)的特異 吸附作用將酶固定到載體 (如硅藻土、陶瓷、塑料等 )表面,方法簡(jiǎn)便,酶活力不受影響,但是吸附的靜電作用力容易受到反應(yīng)液中 pH 的影響。此法最簡(jiǎn)單,但固定后的酶活力不高,固定酶的牢度不強(qiáng)。固定化酶不僅在化學(xué)、生物學(xué)及生物工程、醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域的研究異?;钴S,得到迅速發(fā)展和廣泛的應(yīng)用,而且因?yàn)榫哂?節(jié)省資源與能源、減少或防治污染的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)而符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求 。酶的固定化 (Immobilization ofenzymes)是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi),仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)、并可回收及重復(fù)利用的一類技術(shù)。固定化酶是近十余年發(fā)展起來(lái)的酶應(yīng)用技術(shù),在工業(yè)生產(chǎn)、化學(xué)分析和醫(yī)藥等方面有誘人的應(yīng)用前景 [14]。酶固定化后一般穩(wěn)定性增加,易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離,且易于控制,能反復(fù)多次使用。由于固定化酶的運(yùn)動(dòng)被化學(xué)或物理的方法限制了,能將其從反應(yīng)介質(zhì)中回收,所以它原則上能在批量操作或連續(xù)操作中重復(fù)使用。為克服上述缺點(diǎn),要將游離酶固定化后進(jìn)行應(yīng)用。加之酶反應(yīng)只能分批進(jìn)行,難于連續(xù)化、自動(dòng)化操作。但因?yàn)槊傅幕瘜W(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì),其最大弱點(diǎn)是不穩(wěn)定性,對(duì)酸、堿、熱及有機(jī)溶液容易發(fā)生酶蛋白的變性作用,從而降低或失去活性。第 4 章 酶的固定化 18 第 4 章 酶的固定化研究 固定化酶簡(jiǎn)介 酶是由生物體產(chǎn)生的具有催化活性的蛋白質(zhì),它能特定地促成 某個(gè)化學(xué)反應(yīng)而本身卻不參加反應(yīng),具有催化效率高,條件溫和,反應(yīng)產(chǎn)物污染小,能耗低,反應(yīng)容易控制等特點(diǎn)。在反應(yīng)液中加入濃度為 1mmol/L Cu2+后 , β半乳糖苷酶即失去活力。由表 38可以看出.在各種金屬離子中, K+、 Na+、 Mn2+和 Mn2+在適當(dāng)濃度范圍內(nèi)對(duì) β半乳糖苷酶酶活有促進(jìn)作用,但隨著濃度增加,促進(jìn)作用減弱或變成抑制,其中Mg2+對(duì) β半 乳糖苷酶活力的促進(jìn)效果最明顯,當(dāng)添加濃度為 10 mmol/L 的 Mg2+時(shí),酶活力達(dá)到 %。由圖 372 可以看出,在30 ℃ 和 40℃ 時(shí),保溫處理 4 h 后仍有 85%酶活力 。 因此 β半乳糖苷 的最適酶活力和穩(wěn)定性皆是 pH 值為 。當(dāng) pH 值為 時(shí)。在 pH 值為 ~ 范圍內(nèi)測(cè)定 β半乳糖苷酶的活性,結(jié)果如圖 331所示。所以接種量 為 %效果最佳。 020040060080010000 4 812 24 36 60時(shí)間(h )酶活 圖 34 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力影響 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 由圖 35 可見,隨著接種量的增加, β半乳糖苷酶表達(dá)量逐漸增加,接種量為 %時(shí)達(dá)到最高.以后又隨著接種量的增加 β半乳糖苷酶表達(dá)量逐漸降低。培養(yǎng) 24 h 時(shí) β半乳糖苷酶的表達(dá)量 達(dá)到高峰,為 860,之后逐漸下降,整個(gè)過程呈現(xiàn)出典型的 “S”型。 01230 2 4 6 8 10 12 14 24 30 36 48 60 72時(shí)間hOD值 圖 33 菌株生長(zhǎng)曲線 第 3 章 β半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì) 14 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 由圖 34 可見 , 菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中經(jīng)過 2 h 的延緩期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,經(jīng)過 4 h 的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后,進(jìn)入 平緩 期。菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為培養(yǎng)的第 l0 小時(shí)左右。 鄰硝基苯酚( ONP)標(biāo)準(zhǔn)曲線 東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 13 0 ONP濃度 ( μ mol)OD420 圖 32 鄰硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y= +, R2= 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定 由圖 33 可見 , 單菌落生長(zhǎng)經(jīng)過 6 h 的遲緩期后,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 12 h 后達(dá)到穩(wěn)定期,生長(zhǎng)到 60 h 后由于營(yíng)養(yǎng)的耗盡以及環(huán)境 pH 變化和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累,細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。 表 31 10 株 β半乳糖苷酶水解活性 菌株編號(hào) 特征描述 OD420 酶活 ( U/mL) 1 乳白偏黃,半透明,邊緣圓滑不規(guī)則,菌落中等大小 2 乳白色,幾 乎不透明,邊緣圓滑,菌落很小 3 乳白色,半透明,邊緣圓滑,菌落中等大小 4 乳白色,半透明,邊緣圓滑,菌落很小 5 微紅,半透明,邊緣圓滑,菌落中等偏小 6 乳白色,半透明,邊緣圓滑,菌落較大 7 玫瑰紅色,不透明,邊緣 分枝狀 ,菌落中等偏小 8 淡黃色,半透明,邊緣圓滑,菌落中等偏小 從上表中可看出, 1 號(hào)菌株的酶活性最高,所以 選擇 1 號(hào)菌株作為實(shí)驗(yàn)用菌株。菌種純化后測(cè)定其 β半乳糖苷酶水解活性,得到酶活較高的菌株 8 株。 不同金屬離子及離子濃度對(duì) β半乳糖苷酶的影響 將 β半乳糖苷酶與濃度為 mol/L 磷酸鈉緩沖液 (pH 值為 )混勻,并添加各種不同的金屬離子 (K+、 Na+、 Mg2+、 Mn2+、 Cu2+、 Fe2+、 Ca2+、 Zn2+和 Fe3+),于 37℃ 測(cè)定酶活。 溫度對(duì) β半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定 性的影響 測(cè)定 β半乳糖苷酶粗酶液在不同溫度 (溫度范圍為 2575℃ )時(shí)的酶活力,確定溫度對(duì) β半乳糖苷酶活力的影響。緩沖液分別為醋酸鈉 (pH 值為 ,東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 11 , )、磷酸鈉 (pH 值為 , , 和 )和 Tris—HCl(pH 值為 , 和 ),相對(duì)酶活用百分比來(lái)表示。 接種量對(duì)菌株 BGJ222 產(chǎn)酶能力的影響 將種子菌液以 、 、 、 、 、 、 、 、 、 %的比例接種到裝有 30
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