【正文】 ............................................................................................................28附錄 B 外文文獻(xiàn) ....................................................................................................391 引言我國(guó)關(guān)于菊粉酶研究始于 90 年代，集中在菌株篩選和酶學(xué)性質(zhì)方而。本研究從低溫保存的腐爛菊芋上分離出耐低溫菊粉酶產(chǎn)生菌，以 DNS 比色法從 33株菌株中篩選出菊粉酶高產(chǎn)菌株即 2 號(hào)菌株，其酶活力為 ；通過(guò) PlackettBurmen 試驗(yàn)從豆粕添加量，菊粉添加量，(NH 4) 2SO4 添加量，磷酸氫二鉀添加量，吐溫添加量，氯化鎂添加量，初始 pH 值，氯化鈣添加量中篩選出影響發(fā)酵過(guò)程中菊粉酶活力的主要因素，即為豆粕添加量、初始 pH 值及氯化鈣添加量，再通過(guò)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)探究其最優(yōu)發(fā)酵條件為：豆粕添加量 %，菊粉添加量 2%，(NH 4)2SO4 %，磷酸氫二鉀%，吐溫 %，氯化鎂 %，初始 pH 值 ，氯化鈣添加量 %；得到的此最佳發(fā)酵條件下的酶活力為 。 菊粉酶概述 菊粉酶的簡(jiǎn)介菊粉酶(inulinase)是能夠水解 β2,1D果聚糖果糖苷鍵的一類水解酶，學(xué)名 β2,1D果聚糖酶，又叫 β果聚糖酶， β2,1D果聚糖水解酶，可以在一定的溫度條件下水解菊粉成果糖或低聚果糖 [10]。一般認(rèn)為外切菊粉酶的 I/s 值比內(nèi)切菊粉酶的 I/s 低。研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的菊粉、麥芽糖和低濃度的果糖能夠誘導(dǎo)生成菊粉酶，淀粉對(duì)菊粉酶的影響不大，葡萄糖卻能明顯地抑制菊粉酶活性，這表明菊粉酶有底物專一性 [9]。比利時(shí) orafti 公司投資 20 億比利時(shí)法郎，歷時(shí)數(shù)十年種植菊藝開(kāi)發(fā)生產(chǎn)低聚果糖和菊粉，分別作為食糖和油脂代用品 [21]。利用菊粉酶直接發(fā)酵菊粉，制作功能性食品和飼料添加劑將有巨大的生產(chǎn)開(kāi)發(fā)潛力。篩選出來(lái)的野生菌株往往酶活很低，且許多酵母和真菌合成菊粉酶的能力受到分解代謝物的抑制因此，須對(duì)野生菌株進(jìn)行誘變，以篩選出產(chǎn)酶活高的菌株以 2脫氧 D葡萄糖作為篩子，因?yàn)樗c葡萄糖結(jié)構(gòu)類似，且不能被微生物代謝利用，能夠在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株為解除阻遏菌株。Gupta 等人發(fā)現(xiàn)用從菊芋根中提取出來(lái)的果聚糖作碳源(開(kāi)花前含很少量的葡萄糖和果糖)，比用菊粉作碳源，酶活力有很大提高 [9]。(5)溫度的影響克魯斯假絲酵母(Candidacrusei) 產(chǎn)酶的最適溫度為 2730℃，溫度提高將導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低。 菊粉酶的純化對(duì)于混合酶，酶的純化步驟一般分為:(NH) 2SO4 沉淀、離子交換層析及凝膠過(guò)濾色譜等。外切酶水解蔗糖的活力與轉(zhuǎn)化酶相同，內(nèi)切酶兒乎不水解蔗糖，Hg 2+、Ag +、Mn +強(qiáng)烈抑制酶活，說(shuō)明酶活性中心有SH 基因， Ca2+使酶活增加，吲哚乙酸、EDTA ,磷酸毗哆醇對(duì)酶活沒(méi)有顯著影響 [9]。室溫下靜置 510min，使菌液浸入培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng) 1d；(3)菌種初篩得到高產(chǎn)菌株是一項(xiàng)工作量浩大，獲得幾率低的工作，因此在得到最優(yōu)稀釋度后，要從不同樣品中進(jìn)行大量的菌種分離操作，并從中挑取菌落形態(tài)不同且長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落于初篩培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線，并置于 28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1d，初篩階段至少得到 30 株菌株并接種于斜面培養(yǎng)基中 4℃低溫保存，以待下一步復(fù)篩篩選高產(chǎn)菌株；(4)菌種復(fù)篩以 3%的接種量將上述分離出的菌株分別接種于 250mL 三角瓶（50ml 裝量）的復(fù)篩（產(chǎn)酶）培養(yǎng)基中，并相應(yīng)標(biāo)記，28℃，180r/min 搖床培養(yǎng) 48h，然后用 DNS 比色法測(cè)酶活力，比較篩選出酶活力最高的菌株；并將篩選出的高產(chǎn)菌株接種于斜面培養(yǎng)基中 4℃低溫保存。具體操作：將上述篩選出的高產(chǎn)菌株按照 N=12 的 PlackettBurman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)以 3%的接種量接種于 250mL 三角瓶（50mL 裝量）的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在三角瓶上對(duì)應(yīng)的標(biāo)上試驗(yàn)序號(hào)，28℃，180r/min 搖床培養(yǎng) 48h，然后用 DNS 比色法測(cè)酶活力。(3)菊粉酶活力的測(cè)定方法發(fā)酵結(jié)束后，取 10mL 發(fā)酵液，6000r/min 離心 10min，取上清，制成粗酶液，4℃ 保存（如馬上能測(cè)就不用保存） 。針對(duì)初篩得到的 33 株菌株用 DNS 比色法進(jìn)行酶活力測(cè)定，得出結(jié)果如表 31 所示，結(jié)果表明 2 號(hào)菌株酶活力最高，為 。 (2)響應(yīng)面分析方案及結(jié)果對(duì)豆粕添加量(A) 、初始 pH(B)、氯化鈣添加量(C)作如下變化：X 1=(A3)/1，X 2=(B)/，X 3=()/，以 XX X 3 為自變量，以發(fā)酵結(jié)束后測(cè)得的菊粉酶活性為響應(yīng)面值 Y，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表 10。由此可知，各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，所以，可以利用該回歸方程來(lái)確定最佳提取工藝條件。4 討論 本試驗(yàn)進(jìn)行了耐低溫菊粉酶產(chǎn)酶菌的分離及發(fā)酵條件優(yōu)化研究，但在試驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)一些問(wèn)題，本章將對(duì)這些問(wèn)題逐一進(jìn)行分析討論。 展望由于時(shí)間及成本和設(shè)備問(wèn)題，本研究目前只停留在部分發(fā)酵條件即豆粕、菊粉、磷酸氫二鉀、(NH 4。在此條件下，菌種產(chǎn)菊粉酶活力達(dá) 。由二次多項(xiàng)回歸模型方程得知，方程應(yīng)變量與全體自變量之間線性關(guān)系明顯，回歸方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的均方差和系數(shù)較大，而交互項(xiàng)系數(shù)較小，說(shuō)明響應(yīng)面分析所選的 3 個(gè)因素之間的交互效應(yīng)較小。表 33 PlackettBurman 試驗(yàn)方差分析6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 方差來(lái)源 自由度 平方和 均方 F 值 PrF 顯著性X1 1 *X2 1 X3 1 X4 1 X5 1 *X6 1 X7 1 X8 1 *Table 33 Variance analysis for PlackettBurman experimental results注：*.差異顯著(P＜) ；**.差異極顯著(P＜)。 圖 31 105 稀釋度下的菊粉酶產(chǎn)生菌分離培養(yǎng)結(jié)果Figure 31 The separation training results of inulin enzyme source in bacteria in 105 dilution 菌種篩選 菌種初篩從上述分離得到的菌株中，挑取菌落形態(tài)不同且長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落于初篩培養(yǎng)基平板中進(jìn)行劃線，并置于 28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1d，得到 33 株菌株，如圖所示為初篩結(jié)果。計(jì)算后，得出果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=，R 2=，經(jīng)檢驗(yàn)顯著后，供菊粉酶活力測(cè)定用。每個(gè)因素取兩個(gè)水平：低水平“1 ”和高水平“1” ， “1”為“1”的 倍，另設(shè)兩個(gè)空白項(xiàng)對(duì)應(yīng)表中的 X3 和X9，以考察試驗(yàn)誤差。7H2O %，K 2HPO4 %，菊粉 %，瓊脂 %， ；(3)初篩培養(yǎng)基：同分離培養(yǎng)基；(4)復(fù)篩培養(yǎng)基：(NH 4)2SO4 %，K 2HPO4 %，酵母膏 %，菊粉 %，pH ；(5)種子培養(yǎng)基：同復(fù)篩培養(yǎng)基配方 主要試劑表 21 主要試劑表Table 21 The Main reagent list藥品名稱 品級(jí) 制造商菊粉 食品級(jí) 廣州澤鈺生物科技有限公司豆粕 食品級(jí) 阜新維遠(yuǎn)食品科技有限公司磷酸氫二鉀 分析純 沈陽(yáng)市東興試劑廠硫酸鎂 分析純 沈陽(yáng)市新西試劑廠硫酸銨 分析純 沈陽(yáng)市新西試劑廠氯化鈣 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司氯化鉀 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司氯化鈉 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司氫氧化鈉 分析純 天津市大茂化學(xué)試劑廠無(wú)水硫酸鈉 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司苯酚 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司酒石酸鉀鈉 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司3,5二硝基水楊酸 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司冰醋酸 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司吐溫80 生化試劑 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司D果糖 生化試劑 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司 主要儀器設(shè)備表 22 主要儀器設(shè)備表Table 22 The main instrument equipment list酵母膏 生化試劑 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司蛋白胨 生化試劑 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司牛肉膏 生化試劑 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司瓊脂 生化試劑 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司名稱 型號(hào) 制造商精密 PH 計(jì) PHS3C 型 上海精密科學(xué)儀器有限公司電子分析天平 FA2104N 上海精密科學(xué)儀器有限公司高速冷凍離心機(jī) KDC160HR 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司振蕩培養(yǎng)箱 BS2F 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司恒溫培養(yǎng)箱 DNP9052 型 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 GZX9070MBE 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司超凈工作臺(tái) SWCJ2F1D 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療 設(shè)備廠冰箱 BCD201Q 上海科隆電器紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) UV752 上海欣茂儀器有限公司恒溫水油浴鍋 MF5000 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公 司電爐 JYC19BE2 山東九陽(yáng)小家電有限公司電磁爐 JYC19BE2 山東九陽(yáng)小家電有限公司 技術(shù)路線及操作要點(diǎn) 技術(shù)路線 圖 21 技術(shù)路線圖Figure 21 technology roadmap 操作要點(diǎn)(1)采樣菌源來(lái)自于實(shí)驗(yàn)室一盆低溫保存的腐爛菊芋，采樣時(shí)要各個(gè)部位（垂直方向到水平方向）都采集到，至少做到垂直方向上中下三層，水平方向八個(gè)方位，以保證菌種采集充分，為下一步篩選高產(chǎn)菌株做準(zhǔn)備；采集后的樣品于玻