【文章內(nèi)容簡介】 ZnSO4： 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑 有限公司 ，分析純； NaCl：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純； NaOH：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純； CuSO4： 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 ，分析純； Cu2O：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純； KMnO4：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純； KI：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，分析純 。 試驗(yàn)儀器 試管，移液管，培養(yǎng)皿，玻璃棒，燒杯，錐形瓶，量筒，堿式滴定管，酸式滴定管，膠頭滴管，蒸發(fā)皿，石棉網(wǎng)，小漏斗，試管架，試管夾 ，漏斗，漏斗架 ； 電子天平 (FA2104；上海恒平科學(xué)儀器有限公司 )； 分光光度計(jì) (VIS7220N；北京瑞利分析儀器公司 )； 電熱恒溫水浴鍋 (GSY10；北京市醫(yī)療設(shè)備廠 )； 臺(tái)式高速離心機(jī) (TGL20；武漢中科儀器發(fā)展有限公司 )； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (RE5299；上海亞榮生化儀器廠 )； 索氏提取器 (SXT02；上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司 )； 6 凱式定氮裝置 (SBD100；北京市通潤源機(jī)電技術(shù) 有限公司 )； 調(diào)溫電爐 (SXL1200；上海大恒光學(xué)精密機(jī)械有限公司 )； 酸度計(jì) (MP9000；上海大恒光學(xué)精密機(jī)械有限公司 )； 水浴鍋 (DZKW)， 100 mL 三角瓶 ， 10 mL 刻度吸管， 25 mL 刻度吸管，酸式滴定管， 100 mL 容量瓶， 250 mL 錐形瓶， 大試管： 9 支，容量瓶： 50 mL2 ，刻度吸管： 1 mL3 ， 2 mL1 ，5 mL1 。 試驗(yàn)方法 紅霉素發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵過程，在發(fā)酵過程中，需不斷通入無菌空氣并攪拌，以維持一定的罐壓和溶氧。發(fā)酵過程中應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度、發(fā)酵液還原糖量、 pH 值、溶氧量及發(fā)酵液粘度等，以便紅色糖多孢菌能夠大量合成紅霉素并排至胞外。生產(chǎn)中還要加入消泡劑以控制泡沫。在發(fā)酵期間每隔一定時(shí)間也要取樣進(jìn)行分析、鏡檢及無菌試驗(yàn)，檢測生產(chǎn)狀況，分析或控制相關(guān)參數(shù)。 發(fā)酵液的預(yù)處理和過濾 發(fā)酵液中除含有約 %的紅霉素外，絕大部分是菌絲體、蛋白質(zhì)、色素、油等雜質(zhì)，會(huì)給提取和精制帶來很大的困難。尤以蛋白質(zhì)和油等的存在，在溶媒萃取時(shí)將產(chǎn)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象。一般采用硫酸鋅沉淀蛋白質(zhì)，目的是使菌絲結(jié)成團(tuán)加快過濾速度。因?yàn)榱蛩徜\呈酸性，為了防止紅霉素局部酸解而被破壞，我們一般要 用 NaoH 來調(diào)節(jié) pH 值。在處理濾渣時(shí)也會(huì)遇到一些問題，因?yàn)殇\離子是有毒性的，所以我們改用堿式氯化鋁處理濾渣。經(jīng)過預(yù)處理的發(fā)酵液便可進(jìn)行過濾去除菌絲體及沉淀的蛋白質(zhì)。紅霉素發(fā)酵液過濾采用板框過濾機(jī)。 紅霉素的提取 紅霉素分子結(jié)構(gòu)中有一個(gè)二甲基氨基官能團(tuán)，是一個(gè)弱堿，在酸性條件下與某些酸會(huì)形成鹽，如紅霉素乳酸鹽。如果是純紅霉素堿那么在水中溶解度較小，并且會(huì)隨溫度升高而減小，在 55℃時(shí)溶解度最小，當(dāng) pH＞ 時(shí)紅霉素基本以游離堿的形式存在，能溶于乙酸丁酯中，當(dāng) pH＜ 時(shí)，紅霉素以鹽的形式存在，其 在水中的溶解度隨 pH 降低而迅速增大。提取方法是在乙酸丁酯及水溶液（乙酸緩沖液）中反復(fù)萃取。 發(fā)酵方法 A．搖瓶培養(yǎng) 用種子培養(yǎng)冷凍管取紅霉素菌種接種于 30 度母斜面上，養(yǎng) 7d 接種于 30 度子斜面繼續(xù)培養(yǎng)， 7d 后接種于一級(jí)種子瓶。 30000r/min 培養(yǎng) 4856h 轉(zhuǎn)入二級(jí)種子瓶 30000r/min 繼 7 續(xù)培養(yǎng) 2630h，發(fā)酵培養(yǎng)將上培養(yǎng)好的二級(jí)種子接種于發(fā)酵瓶， 30000r/min 培養(yǎng) 16h。搖瓶裝液量為 50ml/250ml，每組結(jié)果均為 5只搖瓶的平均效價(jià)。 B．發(fā)酵罐培養(yǎng) 種子培養(yǎng)的步驟與搖瓶培養(yǎng)相同，發(fā)酵培養(yǎng)就是將上面培養(yǎng)好的二級(jí)種子接種于 3L發(fā)酵罐自動(dòng)發(fā)酵，同時(shí)控制發(fā)酵罐的發(fā)酵溫度、 PH、 接種量、攪拌速度和溶解氧等條件，培養(yǎng) 16h。 8 第三章 試驗(yàn)結(jié)果 選因素、定水平 （ 1）僅超聲波誘變法定水平 分別取 10ml 出發(fā)菌株的菌懸液于 30 支 25ml 的試管中，放入超聲波清洗器中，水淹沒至試管 2/3 左右，進(jìn)行超聲波處理。超聲波功率分別為 200W、 300W、400W，誘變時(shí)間分別為 0min、 3min、 6min、 9min、 12min、 15min、 18min、 2min、24min、 27min、 30min。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：隨著超聲波誘變時(shí)間的增長，紅色糖多胞菌的致死率都在不斷的增加；在 3 個(gè)不同功率的超聲波誘變中，超聲波功率為 200w 時(shí)，隨著誘變時(shí)間的增長，致死率上升得不明顯，誘變效果不顯著；超聲波功率為400ｗ時(shí)，紅色糖多胞菌很快就全部致死，反而沒有達(dá)到誘變效果；超聲波功率為 300ｗ時(shí)，誘變時(shí)間 20min，致死率接近 83%，且平板上的紅色糖多胞菌菌落大小不均一，誘變效果較好。 （ 2）僅 LiCl 誘變法定水平 Licl 誘變法定水平的實(shí)驗(yàn)采用兩種方法：一是在培養(yǎng)基中加入不同濃度的氯化鋰；二是用不同濃度的氯化鋰處理孢子后在培養(yǎng)。根據(jù)菌株致死率來判斷誘變效果。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一種方法能取得比較好的致死效果，可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)的過程中，培養(yǎng)基中始終有氯化鋰存在，對(duì)紅色糖多胞菌起著長期誘變的作用，因此誘變效果更好。隨著氯化鋰濃度的提高，致死率也隨著提高，當(dāng)氯化鋰濃度超過 %時(shí)，紅色糖多胞菌的致死率增加幅度不在顯著，因此在誘變 中氯化鋰濃度確定為 %。在正交實(shí)驗(yàn)中，氯化鋰濃度分別選 %、 %、 %三個(gè)水平，并分別采用兩種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況選定的因素及其水平： 因素 A：超聲波功率（ W） 水平： 200W 300W 400W 因素 B:誘變時(shí)間（ min） 9 水平： 10min 20min 30min 因素 C:LiCl 濃度（ %） 水平： 因素 D： LiCl 使用方法 水平： 培養(yǎng)基中加入 LiCl 孢子懸浮液里 4h 同時(shí)處理 可以確定此實(shí)驗(yàn)為四因素、三水平實(shí)驗(yàn)，可以選擇正交表 L9(34) 項(xiàng)目 1 2 3 4 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 表頭設(shè)計(jì) 水平 A、 超聲波功率 （ W） B、誘變時(shí)間 （ min） C、 Licl 濃度 （ %） D、 Licl 使用方法 1 200 10 培養(yǎng)基中加 Licl 2 300 20 孢子懸浮液處理 3 400 30 同時(shí)處理 頂行：實(shí)驗(yàn)考慮的因素 最左列：實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的次數(shù)，每一列代表試驗(yàn)中安排的各個(gè)因素的水平 實(shí)驗(yàn)方案及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果 水平 A、超聲波功率 （ W） B、誘變時(shí)間 （ min） C、 Licl 濃度 （ %） D、 Licl 使用方法 1 200 10 培養(yǎng)基中加 Licl 2 300 20 孢子懸浮液處理 3 400 30 同時(shí)處理 10 試驗(yàn)號(hào) A B C D 生物效價(jià)（ ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3 1 2 4649 7 3 1 3 2 3321 8 3 2 1 3 3617 9 3 3 2 1 3867 試驗(yàn)號(hào) A B C D 生物效價(jià)（ ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3 1 2 4649 7 3 1 3 2 3321 8 3 2 1 3 3617 9 3 3 2 1 3867 K1 4032 3610 4225 4326 35351 K2 4150 4261 3810 4145 K3 3602 3912 3748 3313 R 548 651 477 1013 11 （ 1）實(shí)驗(yàn)結(jié)果中重要數(shù)據(jù)的計(jì)算方法： K1即第 j列上水平號(hào)為 1的各實(shí)驗(yàn)結(jié)果之和的平均值 K2 即第 j列上水平號(hào)為 2 的各實(shí)驗(yàn)結(jié)果之和的平均值 K3 即第 j列上水平號(hào)為 3 的各實(shí)驗(yàn)結(jié)果之和的平均值 R 即第 j列的極差或其所在因素的極差 （ 2）計(jì)算公式： Rj=MAX{Kj}MIN{kj} R 值（極差）的作用，一般來說，各列的 R 值（極差）是不相等的，這說明各因素改變時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響是不相同的。極差越大，說明這個(gè)因素的水平的改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大。極差最大的那一列的因素，就是因素的水平改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大的因素，也就是最主要的因素。本題中： DBAC,即因素的影響程度為：氯化鋰使用方法＞超聲波誘變時(shí)間 ＞超聲波功率＞氯化鋰濃度。 (3)