【文章內(nèi)容簡介】 的主要方法。在乳酸發(fā)酵工藝上除了可采用根霉生產(chǎn)L—乳酸外，目前國內(nèi)外都展開了對細菌發(fā)酵生產(chǎn) L—乳酸的研究。原因在于雖然根霉發(fā)酵產(chǎn)乳酸存在對營養(yǎng)要求簡單，可以直接利用大量廉價原料以及能夠得到光學(xué)純度很高的L—乳酸等優(yōu)點，但也存在產(chǎn)酸，對糖利用率都較低，發(fā)酵需要通氧，能耗大，時間長，副產(chǎn)物多等缺點，而細菌厭氧發(fā)酵雖然存在營養(yǎng)要求高，原料成本高等缺點，但有產(chǎn)酸量大，發(fā)酵時間短，無需通氧，能耗低，對糖的轉(zhuǎn)化率較高，理論上可達100%等優(yōu)點而同樣受到研究人員的青睞。Zhang等研究了食淀粉乳桿菌NRRL B 4542直接從淀粉發(fā)酵生產(chǎn) L—乳酸的條件，淀粉的起始濃度為120 g／L，從液化淀粉出發(fā)， g／L的乳酸。Hujanen等對干酪乳桿菌NRRL B—441產(chǎn)L—乳酸進行優(yōu)化， 在葡萄糖濃度為160g／L時， ／L，他們采用廉價的大麥芽提取物加少量酵母膏(4g／L) 取代單獨使用酵母膏( 22g／L )，較大的節(jié)省了生產(chǎn)成本。最近幾年來芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸受到人們的關(guān)注。Danner等采用嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株FA6和IFA9，以葡萄糖為碳源，分批培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)L—乳酸， ％％。Poyat等報道：篩選得到能在52℃生長的一株凝結(jié)芽孢桿菌TB04，能在培養(yǎng)基不滅菌的條件下發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，經(jīng)發(fā)酵條件的優(yōu)化，乳酸的最終濃度55g／L，糖的轉(zhuǎn)化率為92％。路福平等[發(fā)表了芽孢乳酸菌凝結(jié)芽孢桿菌TQ33的篩選及產(chǎn)酸條件的研究結(jié)果，其最適生長溫度45℃—50℃，厭氧條件下，以葡萄糖為碳源發(fā)酵L—乳酸，72h產(chǎn)酸量最高達到 g／L，其中L—乳酸含量占96％以上。新興的發(fā)酵工藝如提取與發(fā)酵相偶聯(lián)的原位分離ISPR技術(shù)等，發(fā)酵的同時提取乳酸，減輕產(chǎn)物抑制，又不產(chǎn)生廢棄副產(chǎn)物，但對設(shè)備要求較高，工藝復(fù)雜，設(shè)備投資大，因此對成熟低成本的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝進行改進后仍可在現(xiàn)階段繼續(xù)用于生產(chǎn)。傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵常用中和劑消除終產(chǎn)物乳酸的抑制，如碳酸鈣，氫氧化鈣，氨水，氫氧化鈉等。其中碳酸鈣成本低，簡單易用，應(yīng)用廣泛，但最終會產(chǎn)生硫酸鈣對環(huán)境不利；氫氧化鈣則難于添加且不利于局部pH控制，最終也產(chǎn)生硫酸鈣因此應(yīng)用不多；氨水不產(chǎn)生副產(chǎn)物，容易控制，但發(fā)酵存在糖酸轉(zhuǎn)化率偏低，發(fā)酵殘?zhí)瞧叩热秉c；應(yīng)用氫氧化鈉則成本偏高，菌體活性較差。 乳酸提取工藝L—乳酸發(fā)酵液的成分復(fù)雜，除L—乳酸外，還包括菌體、殘?zhí)恰⒌鞍踪|(zhì)、色素、膠體、有機雜酸、無機鹽等，所以L—乳酸的提取比較復(fù)雜。常用的方法有如下幾種。乳酸鈣結(jié)晶—酸解工藝是傳統(tǒng)的分離方法。其流程見圖4圖 4 乳酸鈣 結(jié)晶一酸解工藝流程圖該工藝雖具有易于控制、工藝成熟的優(yōu)點，但其流程長，硫酸及活性炭的用量大，副產(chǎn)物量大，勞動強度高，不能有效分離殘?zhí)牵耶a(chǎn)品收取率低。也有濃縮液不結(jié)晶而直接用硫酸酸解乳酸鈣提取乳酸的工藝。 萃取法是使用不溶或微溶于水的有機溶劑，通過物理或化學(xué)萃取方式從粗乳酸中提取乳酸， 然后再反萃取，把乳酸從萃取相中分離出來。萃取法不用石灰或石灰石和硫酸，所以不產(chǎn)生CaSO4廢渣，有利于環(huán)境保護，操作簡便, 占地面積少, 對設(shè)備腐蝕性小, 無細菌污染和操作過程可自動化等優(yōu)點。應(yīng)用萃取法的關(guān)鍵是尋找高效、無毒、水溶性小、經(jīng)濟可行的萃取劑。用于乳酸萃取效果較好的載體為一種水不溶性的長鏈叔胺, 并將載體溶于油醇后去萃取乳酸, 于是載體與乳酸形成乳酸胺絡(luò)合物, 后被有機相萃取分離, 再經(jīng)反萃取, 即可獲得純凈的稀乳酸液, 濃縮蒸發(fā)后即為成品 L—乳酸。近年來，國內(nèi)外開發(fā)出許多新的萃取技術(shù)，如雙水相萃取、膜萃取和超臨界萃取等。經(jīng)鈣鹽法提取的乳酸不能滿足一些對乳酸有耐熱性要求的工業(yè)用途, 如用于聚合物工業(yè)、焙烤食品以及其他一些附加值高的乳酸產(chǎn)品。將鈣鹽法提取后的乳酸產(chǎn)品在高溫條件下進一步同乙醇或甲醇反應(yīng), 產(chǎn)生乳酸乙酯或甲酯, 再蒸餾分離出乳酸酯, 然后水解乳酸酯、提純回收乳酸, 水解時釋放出的醇則可重復(fù)利用。稀乳酸經(jīng)濃縮蒸發(fā)就可制成高純度、 耐熱性好的乳酸, 日本武藏野公司已成功將該法運用于 L—乳酸的工業(yè)生產(chǎn)中,該方法缺點是能耗較高, 裝備的投資也較大。 離子交換樹脂、活性炭和聚乙烯吡啶都被用作吸附劑，不過活性炭吸附容量小，選擇性差， 重復(fù)性差，而離子交換樹脂選擇性高、交換容量大、操作簡單、易于自動控制。吸附法的缺點在于不具備高度專一性，且脫附困難。 分子蒸餾屬于高真空蒸餾技術(shù)，它克服了常規(guī)蒸餾分離效率低、操作溫度高、受熱時間長導(dǎo)致有效成分的聚合、分解等缺點，特別適合于高沸點、熱敏性及易氧化物質(zhì)的分離。通過分子蒸餾提純L—乳酸，可以達到蛋白質(zhì)、重金屬離子清除、脫臭、脫色、提純等目的，得到的乳酸也具有較好的耐熱性。電滲析技術(shù)不僅可以用于偶聯(lián)發(fā)酵，也可單獨用于發(fā)酵液分離提純?nèi)樗?。電滲析法是在離子交換技術(shù)與膜技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分離提純技術(shù)。歐美率先將該技術(shù)運用于 L—乳酸等有機酸的提取,在 L—乳酸的提取過程中使用單極電滲析的目的是分離電解質(zhì)和非電解質(zhì)。 濃縮乳酸鹽, 用雙極電滲析的目的是最終將乳酸鹽變成高純度的乳酸 ,并回收堿回用到發(fā)酵罐中調(diào) pH值。該技術(shù)的最大優(yōu)點是分離提純效果好、 回收率高、 產(chǎn)品質(zhì)量好 ,其缺點是能耗高 ,可以說是極具前景的方法。目前采用該技術(shù)的最大困難是日本和美國壟斷了離子交換膜 ,特別是雙極膜的生產(chǎn)技術(shù) ,將裝備的售價提得較高。 本課題的目的及研究的意義乳酸菌作為一種絕大多數(shù)為益生菌的菌種對人類的健康起著重要作用，而選育出優(yōu)良的乳酸菌菌株對生產(chǎn)有特殊的意義，能夠更突出的表現(xiàn)出乳酸菌的優(yōu)點和功效。然而目前被運用到生產(chǎn)的乳酸菌種十分的固定，自然界中還有許多未知的乳酸菌種值得我們?nèi)ふ液Y選、提純并且誘導(dǎo)。本實驗研究目的在于從自然界篩選及鑒定未知的乳酸菌，使其生理生化特征可以表現(xiàn)出來，從而判斷是否能夠在醬油、酸奶、陳醋等發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)中更好發(fā)揮乳酸菌的作用，更好的達到發(fā)酵的效果，能夠培育出人類生產(chǎn)中所需要的優(yōu)質(zhì)的乳酸菌，方便的應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)中122 實驗部分 實驗材料與儀器 實驗材料自制酸菜汁中篩選出的4株乳酸菌:RRRR4 實驗儀器設(shè)備名稱生產(chǎn)廠家721E型可見分光光度計上海光譜儀器有限公司電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP9162）上海－恒科學(xué)儀器有限公司立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX50KB）上海申安醫(yī)療器械廠空氣振蕩器（HZQC）哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司振蕩器（DZP102）哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司電子天平（FA1104）上海天平儀器廠SWCJ1FD型單人單面凈化工作臺杭州凈化設(shè)備有限公司生化培養(yǎng)箱（LRH70F）上海－恒科學(xué)儀器有限公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG9203A）上海－恒科技有限公司PH計（PHS3C）上海精科紫外分光光度儀（W1000） 上海天美有限公司可見分光光度計（721）天津市普瑞斯儀器有限公司光學(xué)顯微鏡（MoticBA200Digital）日本尼康公司電爐子（SX2410） 天津市中環(huán)實驗電爐子有限公司其他儀器：pH酸度計、試管、容量瓶、量筒、玻璃棒、燒杯、紗布、報紙、錐形瓶、鐵架臺、酒精燈、涂布棒、鑷子等。19哈爾濱商業(yè)大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（論文） 實驗試劑實驗藥品名稱級別生產(chǎn)廠家蛋白胨生物試劑北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司牛肉粉生物試劑北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司干酪素生物試劑北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠葡萄糖分析純天津市天力化學(xué)試劑有限公司氯化鈉分析純天津基準化學(xué)試劑有限公司硫酸銨分析純天津市天力化學(xué)試劑有限公司磷酸氫二鈉分析純天津市天力化學(xué)試劑有限公司磷酸二氫鉀分析純天津市博迪化工有限公司硫代硫酸鈉分析純天津市百世化工有限公司氫氧化鈉分析純天津市博迪化工股份有限公司可溶性淀粉生物試劑北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠明膠生化試劑天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司L酪氨酸生化試劑天津市光復(fù)精細化工研究所石蕊分析純天津市巴斯夫化工有限公司溴甲酚紫分析純天津市光復(fù)精細化工研究所1萘酚分析純天津市光復(fù)精細化工研究所酚酞分析純天津市永太化學(xué)試劑開發(fā)中心對二甲氨基苯甲醛分析純上海試劑工廠酸性品紅生物染色劑北京化工廠無水乙醇分析純天津市天力化學(xué)試劑有限公司95%乙醇分析純天津市天力化學(xué)試劑有限公司 實驗培養(yǎng)基 乳酸菌分離培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基（BCP培養(yǎng)基）配方：5g乳糖、5g酵母浸粉、15g20g瓊脂、5%、1000mlH2O、121℃高壓滅菌15分鐘?；A(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖　，(NH4)2SO4　，檸檬酸鈉　，MgSO47H2O　，K2HPO4　，KH2PO4　，蒸餾水100mL，調(diào)PH 乳酸菌的生理生化鑒定培養(yǎng)基 產(chǎn)硫化氫試驗培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏10 g， g，蒸餾水1000 ml，～，121℃滅菌20 分鐘。石蕊牛乳試驗培養(yǎng)基：% 石蕊水溶液4 ml，脫脂牛奶100 ml，115℃滅菌20 分鐘。硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g，KH2PO4 1 g，MgSO47H2O g，酵母膏 g，KNO3 g，蒸餾水 1000 mL，12