【文章內(nèi)容簡介】 清，500μl70％乙醇洗滌，4℃，12000rpm離心10min，棄上清；(7) 真空干燥10min，加入TE buffer 30μl溶解，20℃保存[7]。 16S rRNA目的基因的PCR擴增及克隆分析 16S rRNA目的基因的PCR擴增(1) PCR引物Forward Primer：Eu27F(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，10μM )；Reverse Primer：1490R(5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′，10μM)；(2) PCR反應16S rRNA 序列的PCR反應體系（50μl）如表5表5 16S rRNA PCR擴增反應體系PCR反應試劑添加量滅菌水(ddwater) μl10Taq 緩沖液（冰上解凍）5 μldNTP( 冰上解凍)4 μlMgCl2（25mM）3μlForward Primer1 μlReverse Primer1 μl模板DNA2 μlTaq DNA 聚合酶(Tiangen，5 U/μl) μl按以下程序在PCR自動擴增儀中對目的基因進行擴增：95℃預熱 5 min95℃變性1 min 50℃退火1 min 35 cycles72℃延伸2 min72℃延伸10 min反應結束后，－20℃保存。(3) 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物取PCR擴增后的產(chǎn)物5 μl，加1 μl 6 loading buffer混勻，%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測擴增效果。DNA Marker VII 5 μl作標準，1 TAE緩沖液介質，4 ~ 10 V/cm直流電電泳。 連接反應（Ligation)和重組DNA的轉化從PGMT ligation Kit劑盒（Tiangen公司）1 μl連接緩沖液加入到200 μl的Eppendorff 管中。然后加入擴增后的DNA片段4 μl，再加入pGMT載體 1 μl ，再加入3 μl ddH2O，T4 DNA ligase 1 μl輕輕混勻后（注：以上添加溶液順序不能顛倒）在PCR儀中16℃過夜連接。連接結束后取3 μl重組質粒DNA加入到冰上已解凍的裝有感受態(tài)大腸桿菌DH5α Eppendoff 管中，輕輕混勻，冰上放置30 min，42℃熱激90s，迅速置冰水浴中2 min，加入已經(jīng)在37℃預熱的SOC培養(yǎng)基300~500 μl，37℃搖床培養(yǎng)45 min。 重組菌落的篩選向含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)皿中加入40 μl Xgal和30 μl IPTG后涂布平板，37℃放置1~3 h，加入100 μl重組大腸桿菌液涂在LB平板上。Eppendoff管中剩余的400 μl重組大腸桿菌DH5α在4℃ 12000 rpm下離心 1 min，倒掉上清液約300 μl，微型震蕩儀上懸震菌體沉淀，吸取菌懸液涂于新的LB平板。涂好后的平板在37℃培養(yǎng)15 h左右，挑選白色的菌落。 重組大腸桿菌的擴大培養(yǎng)將LB液體培養(yǎng)基分裝入試管中，每管約4 mL，121℃，滅菌20 min，冷卻后每管加入5 μl氨芐青霉素（25 mg/mL）。用無菌牙簽挑取白色的單菌落接種于試管中，37℃，150 rpm震蕩培養(yǎng)15~18 h，直至從試管另一面看不到牙簽即可。 重組質粒的提取和鑒定質粒的提取參見質粒小提試劑盒（Omega公司）的說明操作，步驟如下：(1) 柱平衡步驟：向吸收柱CB3中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl的平衡液BL，12000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(2) ，加入到Eppendorf管中，使用普通離心機，12000 rpm離心1分鐘，盡量去除上清液。(3) 向留有菌體沉淀的Eppendorf管中加入250 μl溶液P1（先確認是否已加入RNaseA），使用旋渦混勻器徹底懸浮菌體沉淀。(4) 向Eppendorf管中加入250 μl溶液P2，溫和的上下翻轉46次使菌體充分裂解。(5) 向Eppendorf管中加入350 μl溶液P3，立即上下翻轉，充分的混勻，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000 rpm離心10分鐘，此時在離心管底部形成沉淀。(6) 小心的將上清液用移液槍轉移到吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），注意盡量不要吸出沉淀。室溫放置1~2分鐘，12000 rpm離心30 ~ 60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(7) 向吸附柱CB3中加入700 μl漂洗液PW（先確認是否已加入無水乙醇），12000 rpm，離心30 ~ 60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新裝入收集管中。(8) 向吸附柱CB3中加入500 μl漂洗液PW，12000 rpm（13400g）離心3060秒，倒掉收集管中的廢液。(9) 將吸附柱重新裝入收集管中，12000 rpm離心2分鐘。(10) 將吸附柱CB3放置于一個干凈的Eppendorf管中，向吸附膜的中央部分滴加50 ~ 100 μl洗脫緩沖液EB，室溫放置1分鐘，12000 rpm（13400g）離心2分鐘將質粒溶液收集到Eppendorf管中。(11) 為了增加質粒的回收率，可將得到的溶液重新加入帶有吸附柱的Eppendorf管中，重復（10）的操作。(12) 將上面收集到的質粒DNA保存在20℃?zhèn)溆谩?13) 限制性內(nèi)切酶處理質粒DNA： μl/管、酶EcoR I 1 μl/管，然后再加入質粒DNA 2 μl/管，用手指輕輕彈勻，小型離心機上離心使管壁上的液體落入管底，37℃酶切1 h，電泳檢測。 DNA序列的測定該部分送往成都博瑞克生物技術有限公司完成。 最小抑制濃度（MIC）的測定根據(jù)歐洲抗微生物藥物敏感委員會關于微生物對不同抗生素敏感閾值X的數(shù)據(jù)庫分析菌株的抗生素抗藥性。當分離菌株的最小抑菌質量濃度(Minimal Iinhibitory Concentration, MIC)≤ Xμg/mL時為敏感性菌株，反之當MICXμg/mL為抗藥性菌株。最小抑制濃度的測定采用微量肉湯稀釋法。培養(yǎng)液制備：在2mL MRS液體培養(yǎng)基中接種從平板上挑取的單菌落，然后在30℃環(huán)境中靜止培養(yǎng)過夜，然后用生理鹽水稀釋至每毫升1107 個細胞的濃度，即得到培養(yǎng)液。將STR配制成2048μg/mL的貯存液，MRS液體培養(yǎng)基2倍梯度稀釋成使用液。STR的梯度稀釋濃度為2~1024μg/mL。向96孔板中加入198μL含不同濃度抗生素的MRS液體培養(yǎng)基后，接種2μL分離菌株的培養(yǎng)液（1107CFU/mL），37℃靜止培養(yǎng)24h后，統(tǒng)計不同菌株的MIC，每組實驗重復3次并設置空白對照。3 結果 乳酸菌的分離乳酸菌是指發(fā)酵時能夠產(chǎn)生乳酸的一大類細菌，包括40個屬，近300個種。MRS平板分離乳酸菌時，利用其產(chǎn)生的乳酸溶解CaCO3形成溶鈣圈的特性，實現(xiàn)乳酸菌的初步分離。在當前研究中，從平板中分離得到43個溶鈣圈菌落，編號為為LS1到LS43。 基因組DNA的提取DNA作為分子生物學研究的基礎,在生物領域尤其是遺傳學方面的研究日漸深入，在此基礎上產(chǎn)生的基因工程技術已在醫(yī)藥、畜牧業(yè)等領域獲得廣泛應用。研究和應用DNA的基礎是提取純化結構完整的DNA，實驗中將SDS法和CTAB法結合用于DNA的提取，不僅能使微生物細胞能更完全的得到破碎，并有利于蛋白質等雜質與DNA的分離。實驗結果如圖4。 圖3 Wide Range DNA Marker 圖4 部分乳酸菌的總DNA電泳結果圖由圖4可看出每條泳道均出現(xiàn)清晰的條帶且與Marker的條帶基本一致。實驗中染色劑Goldview中所含有的EB嵌入核酸雙鏈的堿基之間，形成EBDNA復合物。該復合物，經(jīng)紫外光照射