畢業(yè)論文__硒化乳酸菌胞外多糖理化性質(zhì)及其抗氧化活性研究(編輯修改稿)
2024-11-12 08:28 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 可以看出，硒化乳酸菌胞外多糖在水中呈均勻溶解狀態(tài)，而在乙醇和丙酮中沉于底部，在氯仿中呈漂浮狀態(tài)，說明乳酸菌胞外多糖不溶于乙醇，丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑。 多糖的鑒別與分析 淀粉多糖遇碘變藍(lán)，因此可以用碘檢測淀粉多糖。取 lml 濃度為 1mg／ ml的硒多糖溶液加入碘 碘化鉀溶液，觀察顏色變化。以蒸餾水作陰性對照，淀粉溶液 (1mg／ m1)作陽性對照。 結(jié)果表明，硒多糖溶液碘 碘化鉀反應(yīng)呈陰性，說明不含有淀粉多糖。 糖在濃硫酸或濃鹽酸的作用下脫水形成糠醛及其衍生物與 α萘酚作用形成紫紅色復(fù)合物，在糖液和 濃硫酸的液面間形成紫環(huán)，因此又稱紫環(huán)反應(yīng)。自由存在和結(jié)合存在的糖均呈陽性反應(yīng)。此外，各種糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈顏色近似的陽性反應(yīng)。因此，陰性反應(yīng)證明沒有糖類物質(zhì)的存在；而陽性反應(yīng)，則說明有糖存在的可能性，需要進(jìn)一步通過其他糖的定性試驗(yàn)才能確定有糖的存在。 取 lml 濃度為 lmg／ ml的硒多糖溶液，加入 2 滴 Molish 試劑，搖勻，將試管傾斜，沿試管壁慢慢加入 lml 濃硫酸，豎直試管，觀察濃硫酸和糖溶液交界面顏色變化。以蒸餾水作為陰性西安培華學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 硒化乳酸菌胞外多糖理化性質(zhì)及其抗氧化活性研究 4 對照，淀粉溶液 (1mg／ m1)作為陽性對照。 結(jié)果表明，硒多 糖溶液的 Molish反應(yīng)呈陽性，說明硒多糖很可能為多糖。 ① 單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別稱取葡萄糖、鼠李唐、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖，分別溶于蒸餾水中制得五種單糖標(biāo)準(zhǔn)液，濃度均為 1mg/mL。 ② 水解多糖樣品的制備 稱取 20mg 硒 多糖，溶解在 5mL 蒸餾水中，加入 12mol/L 的 HCl ,置于高壓釜中，在 121℃ 條件下水解 4h，中和后稀釋至 10mL，離心。 ③ 展開系統(tǒng)及顯色劑的配制 展開系統(tǒng)：分別把乙酸乙酯、吡啶、無水乙醇、水按 8： 1： 1： 2（ V/V） 的比例混合搖勻。顯色劑的配制（苯胺 二苯胺 磷酸顯色劑）： 2%二苯胺丙酮溶液： 2%苯胺丙酮溶液： 85%磷酸按 5： 5： 1（ V/V） 的比例混合搖勻。 ④ 點(diǎn)樣 將葡萄糖 、鼠李唐、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖的單糖標(biāo)準(zhǔn)液和處理過的樣品液，7 種液體按順序分別點(diǎn)樣在薄層板上。點(diǎn)樣量約 10μL,分次滴加，使點(diǎn)樣擴(kuò)散后直徑不超過 2mm。點(diǎn)樣過程中用吹風(fēng)機(jī)使樣品干燥。 ⑤ 展開 將點(diǎn)好樣品的薄層板置于密閉的層析缸中，用配制的展開劑，采用傾斜上行法，將薄層板的下端浸在展開劑中 ，至展開劑距離薄層板的上端約 1cm 左右時(shí)取出自然風(fēng)干。 ⑥ 顯色 在除去溶劑后的薄層板上，均勻噴上顯色劑，置于烘箱中顯色，烘箱中加熱顯色溫度一般選擇 85℃ 為宜，顯色時(shí)間 10min。 ⑦ Rf 值的測 定 西安培華學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 硒化乳酸菌胞外多糖理化性質(zhì)及其抗氧化活性研究 5 本實(shí)驗(yàn)的硅膠板購自 南京建成生物工程研究所，展層顯色后 ，結(jié)果如下圖 21 所示 圖 21 硅膠板薄層色譜 （從左至右依次為葡萄糖、鼠李唐、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、水解多糖） 表 21 乳酸菌胞外多糖的組分 葡萄糖 鼠李唐 木糖 果糖 半乳糖 甘露糖 標(biāo)準(zhǔn)品 樣品 Rf= － Rf= － Rf= － Rf= － Rf= ＋ Rf= ＋ 從表 21的 Rf值表中可以看出，樣品中出現(xiàn)的兩個(gè)顯色點(diǎn)的 Rf值為 ，跟半乳糖和甘露糖的 Rf值一致， 說明硒化乳酸菌胞外多糖的單糖組分中包括半乳糖和甘露糖。 體外抗氧化活性的測定 對超氧陰離子自由基（ O2 ）清除能力的測定 采用 鄰苯三酚自氧化法 ，鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化，釋放出 O2，生成有色的中間產(chǎn)物，可用分光光度法進(jìn)行測定，當(dāng)有清除劑存在時(shí)， O2被清除，從而阻止中間產(chǎn)物的積累，使鄰苯三酚自氧化速率降低，表現(xiàn)為體系的吸光度降低，所以可通過比色法檢測有色中間產(chǎn)物的含量，進(jìn)而檢驗(yàn)待測物質(zhì)清除 O2的能力，因此入一定量的具有抗氧化作用的不同濃度的多糖液可對 O2產(chǎn)生不同的抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致光吸收值的變化 。 配制 50mmol/L TrisHCl緩沖液（ pH=）， 3mmol/L的鄰苯三酚溶液和不同濃度的樣品溶液。 取濃度為 50mmol/L TrisHCl緩沖液（ pH =） ，加蒸餾水 mL，混勻后西安培華學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 硒化乳酸菌胞外多糖理化性質(zhì)及其抗氧化活性研究 6 在 25℃水浴保溫 20min，取出后立即加入樣品 2 mL，蒸餾水 mL， 25℃保溫的、濃度為 3mmol/L 的鄰苯三酚 mL（以 10mmol/L HCl配制，空白管中以 10mmol/L HCl代替鄰苯三酚溶液），迅速搖勻倒入比色杯，置于 25℃恒溫池中，在 325nm下每隔 30s測一次；測啟動(dòng)后 4min 內(nèi)樣品抑制鄰苯三酚自氧化的速率，記作 V 樣 ，測空白樣反應(yīng)啟動(dòng)后 4min 內(nèi)鄰苯三酚自氧化的速率，記作 V0。每測一個(gè)濃度配一次測樣液，而且配完了就要馬上測定，否則反應(yīng)結(jié) 束了就沒法測速率了。 超氧陰離子自由基 (O2)是在生命活動(dòng)過程中起重要作用的自由基，具有很強(qiáng)的氧化能力，國內(nèi)外學(xué)者大量研究表明一些富含多酚類、黃酮類、皂貳類、翰質(zhì)類、生物堿類、多糖類等成分的天然食物有較強(qiáng)的抗氧化能力。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，對比，優(yōu)化，選擇之后，選取濃度 ， ， ， ， 1， 2， 4， 8mg/mL8個(gè)濃度的測定結(jié)果，經(jīng)數(shù)據(jù)處理后得硒多糖與未硒化多糖在相同濃度范圍內(nèi)清除超氧自由基 （ O2） 清除率比較結(jié)果，如下圖22所示。 圖 22 硒化與未經(jīng)硒化乳酸菌胞外多糖對超氧自由基（ O2）的清除作用 從圖 22可以看出硒化乳酸菌胞外多糖和未經(jīng)硒化的乳酸菌胞外多糖對超氧自由基都具有清除能力，且其清除率都隨濃度的增加增強(qiáng)，在每一濃度下硒化乳酸菌胞外多糖都比未經(jīng)硒化的乳酸菌胞外多糖對 超氧自由基（ O2）的清除作用強(qiáng) ；在低濃度，約 1mg/mL之前，硒化多糖的清除率比未硒化多糖的清除率有上升的趨勢，隨后就慢慢接近平行。當(dāng)多糖濃度達(dá) 4mg/mL 以上時(shí)，硒化乳酸菌胞外多糖對超氧自由基 （ O2） 清除率可以達(dá)到 50%以上。硒化乳酸菌胞外多糖在選定范圍內(nèi)，對超氧自由基 （ O2） 的清除率逐漸增加，最高為 %，相比硒化前的多糖在同樣濃
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