高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的等離子誘變選育畢業(yè)論文(編輯修改稿)
2024-10-01 01:21 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 電爐 丹陽(yáng)市飛和五金電器廠 可見(jiàn)分光光度計(jì) 722 上海佑科儀器儀表有限公司 磁力攪拌器 SK1 金壇市杰瑞爾電器有限公司 美的電冰箱 BCD— 195TC 合肥榮氏達(dá)冰箱有限公司 高通量恒溫振蕩器 Canvic HTST008 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 不銹鋼蒸餾水器 上海生銀醫(yī)療儀器儀表有限公司 本試驗(yàn)還需用品： Eppendorf 離心管、燒杯、玻璃棒、鑷子、試劑瓶、量筒、洗瓶、石棉網(wǎng)、錐形瓶、培養(yǎng)皿、剪刀、白鐵鍋、酒精燈、試管架、冰袋、試劑勺、涂布棒、甘油管等。 培養(yǎng)基及相關(guān)試劑的配制 （ 1） MRS 液體培養(yǎng)基：魚(yú)粉蛋白胨 10g 酵母提取物 10g 葡萄糖 5g 乙酸鈉 5g 磷酸氫二鉀 檸檬酸三胺 硫酸鎂 硫酸錳 吐溫 80 ℃ 滅菌 25 分鐘 （ 2） MRS 固體培養(yǎng)基：魚(yú)粉蛋白胨 10g 酵母提取物 10g 葡萄糖 5g 乙酸鈉 5g 磷酸氫二鉀 檸檬酸三胺 硫酸鎂 硫酸錳 瓊脂 20～ 25g 水 1000mL 115℃ 滅菌 25 分鐘 （ 3）含 GABA 的 MRS 固體培養(yǎng)基：魚(yú)粉蛋白胨 10g 酵母提取物 10g 葡葉楊：高產(chǎn) γ 氨基丁酸乳酸菌的等離子誘變選育 萄糖 5g 乙酸鈉 5g 磷酸氫二鉀 檸檬酸三胺 硫酸鎂 硫酸錳 瓊脂 20～ 25g GABA 60g 水 1000mL 115℃ 滅菌 25 分鐘 （ 4）發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母提取物 5g 胰蛋 白胨 5g 葡萄糖 10g 丁二酸鈉5g 1%的谷氨酸鈉 水 1000mL 115℃ 滅菌 25分鐘 （ 5）生理鹽水溶液： 溶于 200mL 蒸餾水。 115℃ 滅菌 25min。 （ 6）硼酸緩沖液 硼砂和 硼酸溶解后定容至 100mL。 (3)谷氨酸鈉溶液： 的谷氨酸鈉加入 100mL 的無(wú)菌水中，配制用于對(duì)照的谷氨酸鈉溶液。 安徽工程大學(xué)畢業(yè)論文 徽工程大學(xué)畢業(yè) 設(shè)計(jì)（論文） 第 3 章 實(shí)驗(yàn)方法 對(duì)乳酸菌 HX36進(jìn)行 ARTP 誘變育種 乳酸菌 HX36生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 （ 1）菌種的活化：將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株取出，并恢復(fù)至室溫后，按 10%（ v/v）接種量接種 1mL 乳酸菌于裝有 9mL 的 MRS 液體種子培養(yǎng)基的 50mL 三角瓶中，靜置于 30℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 待用。 （ 2 ）乳酸菌生長(zhǎng)曲線繪制：取出上述活化后的菌懸液，按 10%（ v/v）接種量接種接種 1mL 菌懸液到裝有 9mL MRS 液體培養(yǎng)基的 50mL 三角瓶，置于 30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔 3h 用分光光度計(jì)在 600nm 條件下測(cè)得菌液 OD 值，并 以時(shí)間為橫坐標(biāo)， OD值為縱坐標(biāo)繪制乳酸菌的生長(zhǎng)曲線。 同時(shí)用 pH 計(jì)對(duì)乳酸菌菌懸液的 pH 值進(jìn)行測(cè)定。 ARTP 誘變 （ 1） 菌懸液的制備：將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株取出，并恢復(fù)至室溫后，按 10%（ v/v）接種量接種 1mL 乳酸菌于裝有 9mlL 的 MRS 液體種子培養(yǎng)基的 50mL 三角瓶中，靜置于 30℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用，取 1mL 待用菌液于 的離心管中，5000r/min 離心 5 分鐘，離心后去除上清液加入 1mL 的無(wú)菌水使用振蕩器震動(dòng)搖勻，制成菌懸液備用。 （ 2） ARTP 誘變操作： 在無(wú)菌操作臺(tái)上 使用 20μL 移液 槍吸取上述制備好的菌懸液 10μL 到滅菌的小鐵片上（共做 8組）， 8組菌液用 ARTP 進(jìn)行誘變處理的時(shí)間分別為 0s、 30s、 60s、 90s、 120s、 150s、 180s、 210s、 240s。 葉楊：高產(chǎn) γ 氨基丁酸乳酸菌的等離子誘變選育 常壓室溫（ ARTP ） 等離子誘變育種裝置，在本實(shí)驗(yàn)中使用條件如下所述；供電電源： 220V， 50Hz，電壓波動(dòng)范圍 ≤ 5% ，氣體流量選用 10SLM，溫度20～ 40℃ 以下，功率 200W。 用鑷子將待處理樣品載片放置到旋轉(zhuǎn)定位臺(tái)上方菌片固定圓形凹槽內(nèi)，之后調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)定位臺(tái)高度，使待處理樣品距離等離子體發(fā)生器出口為 3 mm，樣品放置完畢后，關(guān)閉操作室門(mén)，選擇照射時(shí)間。 后培養(yǎng)及平板計(jì)數(shù) （ 1）后培養(yǎng)：將誘變后的載有菌液的小鐵片迅速放入裝有 MRS 液體培養(yǎng)基的離心管中，然后將誘變的乳酸菌放入恒溫培養(yǎng)箱中 30℃ 培養(yǎng) 2h。 （ 2）平板計(jì)數(shù)： 2h 后取出誘變菌液使用振蕩器將離心管中的菌液混勻，用1000μL 移液槍吸取 置于裝有 生理鹽水的 7mL 離心管中，依次稀釋至 10 10 10 106，取稀釋倍數(shù) 10 105的兩個(gè)梯度菌懸液（ 0s 取稀釋倍數(shù)為 10 106 的兩個(gè)梯度菌懸液涂布平板），用 200μL 移液槍吸取100μL 加入 MRS 平板，涂布均勻，每個(gè)稀釋度做三個(gè)平行。將涂布后的平板倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中， 30℃ 培養(yǎng) 72h。 （ 3） ARTP 致死率的計(jì)算：培養(yǎng) 72h 后對(duì)平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并與相對(duì)應(yīng)濃度的對(duì)照組菌落數(shù)目進(jìn)行對(duì)照，按照公式：致死率 =（對(duì)照組 誘變菌落數(shù)） /對(duì)照菌落數(shù)，計(jì)算致死率。 突變株的篩選 （ 1） 梯度平板的制備：在無(wú)菌操作臺(tái)，先將平板傾斜 15 度左右放置，倒入約 10mL MRS 瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后放回水平位置，再倒入等體積的含有GABA 濃 度為 60g/L 的 MRS 培養(yǎng)基，凝固后形成梯度平板備用。 （ 2） 突變菌株的初篩：將誘變后菌株分別稀釋 10 105涂布梯度平板，將涂布后的梯度平板倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中， 30℃ 培養(yǎng) 72h（ 0s 不需要涂布梯度平板）。培養(yǎng) 72h 后按 GABA 濃度以及菌落的大小挑選單菌落；驗(yàn)證菌落大小和抗 GABA 濃度高低與菌株產(chǎn) GABA 的相關(guān)性。 （ 3）突變菌株的復(fù)篩 ：對(duì)突變菌株利用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)酵條件為裝液量 50mL 的 250mL 的三角瓶。在恒溫培養(yǎng) 30℃ 靜置培養(yǎng) 72h； 72h 后在640nm 條件利用酶標(biāo)儀測(cè)突變菌株發(fā)酵產(chǎn) GABA 的產(chǎn)量。 安徽工程大學(xué)畢業(yè)論文 徽工程大學(xué)畢業(yè) 設(shè)計(jì)（論文） GABA 含量的測(cè)定 取 1ml 發(fā)酵液于 離心管中 10000r/min 離心 2min，吸取 上清液用無(wú)菌水稀釋 10 倍備用。 取 備用液于平底試管中。再依次分別加入 1mol/L 的碳酸鈉溶液， ， 6%的重蒸苯酚 ，混勻后加入次氯酸鈉 (NaClO)溶液 2mL，混勻后放置 4～ 8 分鐘，然后沸水浴 10min，立即冰浴 20min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入 4mL 60%的乙醇溶液，混勻后室溫 3 放置 20min，待上述溶液制作好后，從每組溶液中吸取 200μL 加入到酶標(biāo)板上，用酶標(biāo)儀在 640nm 條件下對(duì)每組溶液進(jìn)行 GABA 的含量測(cè)定；用酶標(biāo)儀測(cè)定 GABA 的標(biāo)準(zhǔn)。 圖 31 GABA的酶標(biāo)儀標(biāo)準(zhǔn)曲線 菌種保藏 對(duì)反復(fù)篩選并經(jīng)過(guò)多次傳代得到的高產(chǎn) GABA 的乳酸菌突變菌株用甘油管在 70℃ 進(jìn)行冷凍保種。 對(duì)乳酸菌 L1201進(jìn)行 ARTP 誘變育種 菌種來(lái)源 L1201 是
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