【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 也可用于選擇分離放線菌。在分離除鏈霉菌以外的放線菌時(shí)，先將土樣在空氣中干燥，再加熱到100℃保溫1h，可減少細(xì)菌和鏈霉菌的數(shù)量。分離耐高濃度酒精和高滲酵母菌時(shí)，可分別將樣品在高濃度酒精和高濃度蔗糖溶液中處理一段時(shí)間，殺死非目的微生物后再進(jìn)行分離。對(duì)于含菌數(shù)量較少的樣品或分離一些稀有微生物時(shí)，采用富集培養(yǎng)以提高分離工作效率是十分必要的。但是如果按通常分離方法，在培養(yǎng)基平板上能出現(xiàn)足夠數(shù)量的目的微生物，則不必進(jìn)行富集培養(yǎng)，直接分離、純化即可。 第三節(jié) 微生物的分離 經(jīng)富集培養(yǎng)以后的樣品，目的微生物得到增殖，占了優(yōu)勢(shì)，其他種類的微生物在數(shù)量上相對(duì)減少，但并未死亡。富集后的培養(yǎng)液中仍然有多種微生物混雜在一起，即使占了優(yōu)勢(shì)的一類微生物中，也并非純種。例如同樣一群以油脂為碳源的脂肪酶產(chǎn)生菌，有的是細(xì)菌，有的是霉菌，有的是芽孢桿菌，有的不產(chǎn)芽孢，有的生產(chǎn)能力強(qiáng)，有的生產(chǎn)能力弱等等。因此，經(jīng)過富集培養(yǎng)后的樣品，也需要進(jìn)一步通過分離純化，把最需要的菌株直接從樣品中分離出來。一、好氣微生物的分離 分離的方法很多，大體可分為兩類：一類較為粗放，只能達(dá)到“菌落純”，如稀釋涂布法，劃線分離法，組織分離法等。前兩種方法由于操作簡(jiǎn)便有效，工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較多。組織分離法則通常是從有病或特殊組織中分離菌株。另一類是較細(xì)的單細(xì)胞或單孢子分離方法，可達(dá)到“菌株純”或“細(xì)胞純”的水平。這類方法需采用專門的儀器設(shè)備，復(fù)雜的如顯微操作裝置，簡(jiǎn)單的可利用培養(yǎng)皿或凹玻片作分離小室進(jìn)行分離。下面對(duì)這幾種分離純化方法分別加以介紹。 （一）稀釋涂布法 把土壤樣品以十倍的級(jí)差，用無菌水進(jìn)行稀釋，取一定量的某一稀釋度的懸浮液，涂抹于分離培養(yǎng)基的平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，長(zhǎng)出單個(gè)菌落，挑取需要的菌落移到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。土壤樣品的稀釋程度，要看樣品中的含菌數(shù)多少，一般有機(jī)質(zhì)含量高的菜園土等，樣品中含菌量大，稀釋倍數(shù)高些，反之稀釋倍數(shù)低些。采用該方法，在平板培養(yǎng)基上得到單菌落的機(jī)會(huì)較大，特別適合于分離易蔓延的微生物。（二）劃線分離法 用接種環(huán)取部分樣品或菌體，在事先已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基平板上劃線，當(dāng)單個(gè)菌落長(zhǎng)出后，將菌落移入斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后備用。該分離方法操作簡(jiǎn)便、快捷，效果較好。 在樣品含菌量較少或某種目的微生物不多的情況下，微生物的純種分離方法可以簡(jiǎn)化如下：第一種方法，取一支盛有3～5ml無菌水的粗試管或小三角瓶，取混勻的樣品少許（）放入其中，充分振蕩分散，用滅菌滴管取一滴土壤懸液于瓊脂平板上涂抹培養(yǎng)，或者用接種環(huán)接一環(huán)于平板上劃線培養(yǎng)。這種方法不需要菌落計(jì)數(shù)，比以上常規(guī)稀釋法簡(jiǎn)便。第二種方法，取風(fēng)干粉末狀的土樣少許（幾十毫克）直接灑在選擇性分離培養(yǎng)基平板上或混入培養(yǎng)基中制成平板，置適溫培養(yǎng)一定時(shí)間，長(zhǎng)出菌落。例如分離小單孢菌就可采用該方法，從河泥中取樣，風(fēng)干研碎，取樣品粉末20～50mg直接加到天門冬酰胺培養(yǎng)基中，混合均勻制成平板，培養(yǎng)后長(zhǎng)出魚卵狀菌落。這種方法有時(shí)分離不夠充分，可用劃線法進(jìn)一步純化。（三）利用平皿的生化反應(yīng)進(jìn)行分離 這是一種利用特殊的分離培養(yǎng)基對(duì)大量混雜微生物進(jìn)行初步分離的方法。分離培養(yǎng)基是根據(jù)目的微生物特殊的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)來設(shè)計(jì)的。通過觀察微生物在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況或生化反應(yīng)進(jìn)行分離，可顯著提高菌株分離純化的效率。 在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁。能分解底物的微生物便會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)該菌株利用底物的能力。該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時(shí)采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會(huì)在含有底物的選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見的透明圈。在分離淀粉酶產(chǎn)生菌時(shí)，培養(yǎng)基以淀粉為惟一碳源，待樣品涂布到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)形成單個(gè)菌落后，再用碘液浸涂，根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明的水解圈來區(qū)別產(chǎn)酶菌株。如要分離該酸水解酶產(chǎn)生菌，可用雙層平板法，首先在普通平板培養(yǎng)基上把懸浮液涂抹培養(yǎng)，等長(zhǎng)出菌落后覆蓋一層營(yíng)養(yǎng)瓊脂，內(nèi)含3%酵母RNA，%，于42℃左右培養(yǎng)2～4h,四周產(chǎn)生透明圈的菌落，即為核酸分解酶產(chǎn)生菌。 在分離某種產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株時(shí)，也通常采用透明圈法進(jìn)行初篩。在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板成混狀，將樣品懸浮液涂抹到平板上進(jìn)行培養(yǎng)，由于產(chǎn)生菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以輕易地鑒別出來。分離乳酸產(chǎn)生菌時(shí)，由于乳酸是一種較強(qiáng)的有機(jī)酸，因此，在培養(yǎng)基中加入的碳酸鈣不僅有鑒別作用，還有酸中和作用。 對(duì)于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來。如篩選果膠酶產(chǎn)生菌時(shí)，%果膠為惟一碳源的培養(yǎng)基平板，對(duì)含微生物樣品進(jìn)行分離，待菌落長(zhǎng)成后，%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會(huì)出現(xiàn)絳紅色水解圈。在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍(lán)，它是一種酸堿指示劑，～。若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌，其菌落周圍會(huì)變成黃色，可以從這些產(chǎn)酸菌中篩選谷氨酸產(chǎn)生菌。 在進(jìn)行解脂微生物的分離時(shí)，雖然有很多精確的測(cè)定方法，如酸堿滴定法、電位滴定法、濁度滴定法、甘油滴定法及色譜分析法等，但由于步驟繁瑣，不適于大規(guī)模篩選測(cè)定。為提高分離篩選效率，多采用固體平板的變色圈法，如以吐溫為底物，尼羅藍(lán)（Nile blue）作為指示劑，根據(jù)變色圈大小來判斷脂肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯為底物，羅丹明B為指示劑，以熒光圈的大小來測(cè)定。最常使用的方法是把惡秦染料中的維多利亞藍(lán)和脂類底物混合，制成維多利亞藍(lán)乳脂瓊脂培養(yǎng)基平板，起始培養(yǎng)基調(diào)為中性，當(dāng)土壤樣品的懸濁液分離在平板上，具有脂解能力的 菌落產(chǎn)生的脂肪酶水解油脂底物，使pH值由中性下降到微酸性或酸性，陽性解脂反應(yīng)能顯示粉紅到藍(lán)色的變化。如培養(yǎng)基起始pH為堿性，則陽性解脂反應(yīng)從咖啡色到藍(lán)綠色，能使脂類底物和解脂后的脂肪酸區(qū)別開來。后來又由Fryer等研究出一種改良的雙層法，先在平皿內(nèi)倒一層營(yíng)養(yǎng)瓊脂，把一張棉紙圓片在被維多利亞藍(lán)染了色的乳脂中浸濕，鋪在已凝固的瓊脂表面，然后覆蓋一薄層含樣品的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，保溫培養(yǎng)，解脂菌落就可以在棉紙中產(chǎn)生藍(lán)帶。分解解脂細(xì)菌的培養(yǎng)基（％）為：、維多利亞藍(lán)4mg。 分離內(nèi)肽酶產(chǎn)生菌，除了用酪蛋白作底物平板產(chǎn)生透明圈進(jìn)行鑒別外，還可以用吲羥乙酸酯為底物加到分離培養(yǎng)基中，產(chǎn)生蛋白酶的菌落由于水解吲羥乙酸酯為3羥基吲哚，后者能氧化生成藍(lán)色產(chǎn)物，根據(jù)呈色圈便可選出平板上產(chǎn)蛋白酶的菌落。培養(yǎng)基平板由兩層組成，％，％，％，％，待凝固后在其上覆蓋一層瓊脂，％，。 通過平板上的變色圈還可以快速分離篩選產(chǎn)乙醇的菌株。在以糖為碳源的瓊脂平板的菌落上，覆蓋一層含有鹽類的瓊脂，該藍(lán)色物質(zhì)在醇脫氫酶和NAD作用下（在少量乙醇存在時(shí)）反應(yīng)產(chǎn)生的電子脫色。因此生成乙醇的菌落便顯出一個(gè)淡白色的圈，暈圈的大小可初步表示乙醇的產(chǎn)量。 生長(zhǎng)圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌。工具菌是一些相對(duì)應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營(yíng)養(yǎng)物的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營(yíng)養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍周圍便會(huì)形成一個(gè)混濁的生長(zhǎng)圈。如嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌（）與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長(zhǎng)圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌。 同樣，只要是篩選微生物所需營(yíng)養(yǎng)物的產(chǎn)生菌時(shí)，都可采用生長(zhǎng)圈法，工具菌用 相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，由于得到所需營(yíng)養(yǎng)，凡是目的微生物周圍便會(huì)出現(xiàn)混濁的生長(zhǎng)圈。 常用于抗生素產(chǎn)生菌的 分離篩選。通?？股氐暮Y選要投入極大的人力、財(cái)力和時(shí)間。據(jù)估計(jì)，篩選1萬個(gè)菌株才能得到1株有用的生產(chǎn)菌。因此設(shè)計(jì)一個(gè)準(zhǔn)確、迅速的篩選模型十分重要。 抑菌圈法是常用的初篩方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制菌生長(zhǎng)的 物質(zhì)，