【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部， 2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以 9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致 tetr 基因的失活；另外有 3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)， Example: a. 在 pBR322質(zhì)粒的 BamH或 Sal?位點(diǎn)插入外源 DNA片斷，切斷了 tetr基因編碼序列的連續(xù)性，使之失去活性，產(chǎn)生出 AmprTets表型的重組 pBR322質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入 AmpsTets的大腸桿菌細(xì)胞。先涂布在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，篩選出具 Ampr菌落，再將它們涂布于含四環(huán)素的選擇性培養(yǎng)基上。插入外源片斷的重組質(zhì)粒不能在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。 Pst?或 Sca?識(shí)別位點(diǎn)插入外源片斷會(huì)導(dǎo)致 Ampr基因的失活，產(chǎn)生 AmpsTetr表型的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌之后，獲得的重組子可以比較快的檢測(cè)出來(lái)。其依據(jù)是 Ampr表型的細(xì)胞可以合成 β –內(nèi)酰胺酶，它能使青霉素轉(zhuǎn)變成青霉酮酸，而這種青霉酮酸能與碘結(jié)合。在含有可溶性淀粉和四環(huán)素的富裕培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子，經(jīng) 37度培養(yǎng)過(guò)夜后，在此平板上加入少量的碘指示劑溶液產(chǎn)生青霉素 β –內(nèi)酰胺酶 Ampr的菌落，其周?chē)牡庵甘緞┤芤鹤兊妹髁粒?Amps菌落無(wú)此反應(yīng)。 具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增之后每個(gè)細(xì)胞中可積累 1000~3000個(gè)拷貝。 pBR322質(zhì)粒載體的改良 為了更加實(shí)用，人們對(duì) pBR322質(zhì)粒進(jìn)行了改良，得到許多 pBR322質(zhì)粒衍生質(zhì)粒，它們各自具有不同的特點(diǎn)。 應(yīng)用 pBR322質(zhì)粒作為基因克隆載體 — 水稻葉綠體光誘導(dǎo)基因 psbA的結(jié)構(gòu)分析 基因 psbA編碼的蛋白質(zhì)，與光合作用系統(tǒng) ?相關(guān)，并且它能與除草劑阿特拉津結(jié)合，它的第 264位氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，由絲氨酸變?yōu)楦拾彼?，可?dǎo)致其失去與 除草劑阿特拉津結(jié)合的能力 ，推測(cè)是三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變 ；在原生生物衣藻、藍(lán)色細(xì)菌中，此蛋白質(zhì)在同一位臵由絲氨酸變?yōu)楸彼岬娜〈磻?yīng)，會(huì)使他們獲得對(duì)除草劑的抗性功能。 而且，非競(jìng)爭(zhēng)條件下，對(duì)除草劑阿特拉津抗性的千里光屬和莧屬，干物質(zhì)產(chǎn)量比敏感植物下降了 25%和 40%。 通過(guò)對(duì)基因 psbA的體外操作，有可能創(chuàng)造出抗除草劑的或高光效的轉(zhuǎn)基因植株。用pBR322質(zhì)粒作為載體，成功的克隆了水稻的psbA基因。 首先將水稻葉綠體 DNA，用 EcoR?內(nèi)切酶消化，經(jīng)含有溴化乙錠的熔點(diǎn)瓊脂糖電泳，回收分子大小為 ～ DNA片斷。 再與經(jīng)過(guò) EcoR?內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理的 pBR322質(zhì)粒 DNA連接。 然后轉(zhuǎn)化給大腸桿菌，在氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，形成 Ampr轉(zhuǎn)化子菌落群體。 用經(jīng) 32p標(biāo)記的玉米 psdADNA探針作菌落雜交，從 1000多個(gè)菌落中篩選出 8個(gè)陽(yáng)性克隆。 對(duì)這 8個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的Southern分析，表明 6個(gè)片斷帶有長(zhǎng)度為 psdA基因。實(shí)際上其中 psdA基因的全部序列。通過(guò) dna序列分析表明與高等植物的同原性在 92%，與藍(lán)色細(xì)菌同源性 75% 3. pUC質(zhì)粒載體 人們應(yīng)用多克隆位點(diǎn)技術(shù)，在 pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其 5’端帶有一段多克隆位點(diǎn)的 lacZ’基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。 一種典型的 pUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個(gè)部分： 來(lái)自 pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ ori）； 氨芐青霉素抗性基因（ ampr ） ,但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不在含有原來(lái)的核酸內(nèi)切限制酶的但識(shí)別位點(diǎn)。 大腸桿菌 β 半乳糖基因（ lacZ）的啟動(dòng)子及編碼 α 肽鏈的 DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱(chēng)之為 lacZ’基因； 位于 lacZ’基因中的靠近 5’端的一段多克隆位點(diǎn)（ MCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。 Ampr ori pUC18 (3 kb) MCS (Multiple cloning sites, 多科隆位點(diǎn)） Lac promoter lacZ’ pUC質(zhì)粒載體的形體圖 pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn) 第一， 具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù) 。 僅保留了 pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)；在操作過(guò)程中復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變?cè)斐闪嘶?rop的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個(gè)細(xì)胞 500~700個(gè)拷貝。 第二，適用于組織化學(xué)檢測(cè)重組體； 具有來(lái)自大腸桿菌 lac操縱子的 lacZ’基因，所編碼的 α 肽鏈可參與 α 互補(bǔ)作用，用 Xgal顯色對(duì)重組子進(jìn)行鑒定，而 pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。 第三，具有多克隆位點(diǎn) MCS區(qū)段． 方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。 喪失遷移功能的質(zhì)粒載體 能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體 穿梭質(zhì)粒載體 （ 1）喪失遷移功能的質(zhì)粒載體 第一：擁有較高水平的拷貝數(shù) ,平均每個(gè)大腸桿菌寄主細(xì)胞可達(dá) 30~45份 。 第二 :失去了 bom位點(diǎn)，即便在共存的 F質(zhì)粒提供轉(zhuǎn)移裝臵的條件下，也不可能發(fā)生遷移作用。 （ 2）能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體 pGEM3Z是一種與 pUC系列十分類(lèi)似的小分子的質(zhì)粒載體，總長(zhǎng)度 2743bp，編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)lacZ’基因。 pGEM3Z與 pUC質(zhì)粒之間的主要區(qū)別是，它具有兩個(gè)來(lái)自噬菌體的啟動(dòng)子，即T7啟動(dòng)子和 SP6啟動(dòng)子，它們?yōu)?RNA聚合酶的附著作用提供了特異的識(shí)別位點(diǎn)。 （ 3）穿梭質(zhì)粒載體 （ shuttle plasmid vector ） 是指一類(lèi)由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。 早期發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌 枯草桿菌穿梭質(zhì)粒載體 大腸桿菌 釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體 大腸桿菌 牛乳頭瘤病毒 迄今還沒(méi)有發(fā)展出適用的大腸桿菌 植物細(xì)胞穿梭載體。 Ⅱ 噬菌體載體 （ Bacteriophage，簡(jiǎn)稱(chēng) phage） （一）、 噬菌體的一般生物特性 可脫離寄主細(xì)胞生存，但不能進(jìn)行復(fù)制。 除了對(duì)寄主的依賴(lài)性，還具備其它的功能： 保護(hù)自己的核苷酸分子（ DNA、 RNA）免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞； 將其核苷酸分子注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞； 將被感染的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系，從而長(zhǎng)生出大量的子代噬菌體顆粒； 使感染的細(xì)菌細(xì)胞釋放出子代的噬菌體顆粒 1. 噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類(lèi)型 ： 結(jié)構(gòu)： 無(wú)尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、 具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、 線(xiàn)狀體型 核酸類(lèi)型：最常見(jiàn)的是雙鏈線(xiàn)性 DNA、 雙鏈環(huán)形 DNA、 單鏈環(huán)形 DNA、 單鏈線(xiàn)形 DNA、 單鏈 RNA。 不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的。大分子量的噬菌體生命周期比較復(fù)雜；對(duì)寄主的依賴(lài)性較低。 有些噬菌體的 DNA堿基不是由標(biāo)準(zhǔn)的A/T/C/G組成的。 Example： T4噬菌體 DNA沒(méi)有 C堿基，取代的是 5羥甲基胞嘧啶（ HMC） 。SP01噬菌體 DNA中沒(méi)有 T堿基，取代的是 5羥甲基尿嘧啶（ HMU）。 噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期 只具有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。 烈性噬菌體溶菌生長(zhǎng)的基本過(guò)程： 吸附 吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接受器上 注入 噬菌體 DNA穿過(guò)細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞 轉(zhuǎn)變 被感染的細(xì)胞成為制造噬菌體顆粒的場(chǎng)所 合成 大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì) 組裝 包裝了 DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒 釋放 合成的子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái) 溶源生長(zhǎng)周期： 是指在感染過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生出子代 噬菌體顆粒，噬菌體的 DNA是整 合到寄主細(xì)胞染色體 DNA上，成 為它的一個(gè)組成部分。 現(xiàn)知道只有雙鏈 DNA的噬菌體才具有溶源周期 溫和噬菌體：既能進(jìn)入溶菌生命周期又能進(jìn)入溶 源生命周期。 溶源性細(xì)菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細(xì)菌 溶源化： 用溫和噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物使之形成溶 源性細(xì)菌的過(guò)程 整合： 噬菌體的 DNA是被包容在寄主細(xì)胞染色體 DNA中 原噬菌體：在溶源細(xì)菌內(nèi)存在的整合的或非整合的 噬菌體 超感染免疫性：溶源性細(xì)菌不能夠被頭一次感染并 使之溶源化的同種噬菌體再感染。 溶源周期的主要特征： λ 噬菌體和 P1噬菌體 λ 噬菌體的特征： 噬菌體的 DNA分子注入細(xì)菌細(xì)胞 經(jīng)過(guò)短暫的轉(zhuǎn)錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉(zhuǎn)錄活性便被一種阻遏物所關(guān)閉 噬菌體的 DNA分子插入到細(xì)菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體 細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)、增值，噬菌體的基因作為細(xì)菌染色體的一部分進(jìn)行復(fù)制。 噬菌體 P1基本特征： 不存在噬菌體 DNA分子的整合作用體系，而是變成了一種進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的環(huán)形的質(zhì)粒 DNA分子。 （二）、 λ噬菌體載體 溶菌階段 (復(fù)制和釋放 ) λ噬菌體載體的主要類(lèi)型 1. 插入式載體 一種只具有一個(gè)可供外源 DNA插入的克隆位點(diǎn)的 派生載體。 2. 替換型載體（取代型載體） 具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這 兩個(gè)位點(diǎn)之間的λDNA區(qū)段可以被外源插入的 DNA片段所取代。 3. 凱倫噬菌體載體 插入式載體： λ 噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來(lái)說(shuō)，克隆片段較大，所以一般用于 cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)的構(gòu)建。 ?cI基因插入失活：如 λ gt10 、 λNM1149 等載體，在 cI基因上有 EcoR I及 Hind III的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致 cI基因的失活。 cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。 ?Lac Z基因插入失活：如 charon16A載體，在非必須區(qū)段引入 lac Z基因，在 lac Z基因上有 EcoR I位點(diǎn)，插入失活后利用 Xgal法篩選（蘭白篩選）。 替換式載體 野生型噬菌體染色體的中段對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制是非必要的 ， 外源 DNA可以取代這一片段 ， 例如Charon 4A、 λEMBL 3/ Charon40等載體 ， 這些載體是用 Lac 5（ 乳糖操縱子的大部分系列 ， 包括完整的 Lac Z） 替換入噬菌體的中間區(qū)段 ， 同時(shí)將 Lac 5作為選擇標(biāo)記 ， 使用時(shí)用 EcoRI水解 ， 去掉中間的片段 ，再與欲克隆片段在體外進(jìn)行重組 、 包裝 。 而后 ， 感染 ， 并裂解 ， 形成空斑 。 換型噬菌體 λ 是使用最廣泛的載體 。 λ 取代載體 2. 組裝 . 1. 連接 3. 侵染 體外包裝 λ 噬菌體 DNA體外重組后，一般必須經(jīng)過(guò)體外包裝，然后以噬菌體感染的方式將重組 DNA導(dǎo)入 。這是因?yàn)橐愿腥痉绞綄?dǎo)入細(xì)胞的頻率可達(dá)106~108/μgDNA ，而以轉(zhuǎn)染（ translation）的方式導(dǎo)入的頻率僅為 103~105/ μgDNA 。 λ 噬菌體的包裝限制為野生噬菌體 DNA（約 kb）的 75%~105%。 由于 λ 噬菌體包裝時(shí)，當(dāng) DNA的長(zhǎng)度短于野生型的 78%或超過(guò) 105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型 DNA（ ）的75%~105%左右的ＤＮＡ，要求 λ 載體 DNA和外源 DNA長(zhǎng)度之和在 39～53kb之間。