【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 切酶 酶 II——核酸外切酶 酶 III——DNA聚合酶 酶 IV——DNA連接酶 （一）自發(fā)突變與育種 從生產(chǎn)中育種 定向培育優(yōu)良菌株 （二）誘變育種 二、突變與育種 指 利用物理、化學(xué)等誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，采用簡(jiǎn)便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合目的的突變株，以供科學(xué)試驗(yàn)或生產(chǎn)實(shí)踐使用。 誘變育種的基本環(huán)節(jié) 誘變育種的原則 突變株的篩選方法 產(chǎn)量突變株的篩選 抗藥性突變株的篩選 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 春日霉素產(chǎn)生菌的孢子懸液 ? 誘變 ? 涂布平板 ? 培養(yǎng) 2天（ 29℃ ） 培養(yǎng) 45天 (29℃ ) 生物鑒定板上含供試菌種 ? 培養(yǎng) 1718小時(shí) (29℃ ） ? 檢查抑菌圈的大小 保持合適的溫、濕度 產(chǎn)量突變株的篩選 ? 抗藥性突變株的篩選 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株 ? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 是指通過(guò)誘變產(chǎn)生的，由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng)的突變株。 ? 基本培養(yǎng)基（ MM，符號(hào)為 []） 是指僅能滿足某微生物的野生型菌株生長(zhǎng)所需的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基 (CM，符號(hào)為 [+])是指可滿足某種微生物的一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的營(yíng)養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。 ? 補(bǔ)充培養(yǎng)基（ SM，符號(hào)為 [A]或 [B]等） 是指在基本培養(yǎng)基中添加某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以滿足該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺陷型菌株生長(zhǎng)需求的合成或半合成培養(yǎng)基。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 ? (1)與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型有關(guān)的三類培養(yǎng)基 ? 基本培養(yǎng)基 (minimal midium， MM) — [] ? 完全培養(yǎng)基 (plete medium,CM) — [+] ? 補(bǔ)充培養(yǎng)基 (supplemental medium,SM) — [A] ? （ 2） 與營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變有關(guān)的菌體 ? 野生型 (wild type) — 能在 []中生長(zhǎng) ? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 (auxotroph)— 能在 [+]或 [A]生長(zhǎng) ? 原養(yǎng)型 (prototroph)— 能在 []中生長(zhǎng) 抗生素法 菌絲過(guò)濾法 青霉素法 制霉菌素法 原菌株 (出發(fā)菌株 ) 誘變劑處理 淘汰野生型 檢出缺陷型 鑒定缺陷型 同一培養(yǎng)皿 夾層培養(yǎng)法 限量補(bǔ)充培養(yǎng)法 不同培養(yǎng)皿 逐個(gè)檢出法 影印接種法 生長(zhǎng)譜法 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 夾層培養(yǎng)法 夾層培養(yǎng)法 先在培養(yǎng)皿底部倒一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，待凝，添加一層混有經(jīng)誘變劑處理菌液的基本培養(yǎng)基，其上再澆一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，對(duì)首次出現(xiàn)的菌落用記號(hào)筆一一標(biāo)在皿底。然后再加一層完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)后新出現(xiàn)的小菌落多數(shù)都是營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。 限量補(bǔ)充培養(yǎng)法 ? 限量補(bǔ)充培養(yǎng)法 把誘變處理后的細(xì)胞接種在含有微量（＜ %）蛋白胨的基本培養(yǎng)基平板上，野生型細(xì)胞就迅速長(zhǎng)成較大的菌落，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型則緩慢生長(zhǎng)成小菌落。若需獲得某一特定營(yíng)養(yǎng)缺陷型，可再在基本培養(yǎng)基中加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 逐個(gè)檢出法 ? 逐個(gè)檢出法 把經(jīng)誘變處理的細(xì)胞群涂布在 完全培養(yǎng)基 的瓊脂平板上，待長(zhǎng)成單個(gè)菌落后，用接種針或滅過(guò)菌的牙簽把這些單個(gè)菌落逐個(gè)整齊地分別接種到 基本培養(yǎng)基平板 和另一完全培養(yǎng)基平板上，使兩個(gè)平板上的菌落位置嚴(yán)格對(duì)應(yīng)。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基平板的某一部位上長(zhǎng)出菌落，而在基本培養(yǎng)基的相應(yīng)位置上卻不長(zhǎng)，說(shuō)明此乃營(yíng)養(yǎng)缺陷型。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 影印接種法 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 a b c [] [+] 影印平板法 將誘變劑處理后的細(xì)胞群涂布在一完全培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)長(zhǎng)出許多菌落。用特殊工具 ——“印章 ” 把此平板上的全部菌落轉(zhuǎn)印到另一基本培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，比較前后兩個(gè)平板上長(zhǎng)出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)在前一培養(yǎng)基平板上的某一部位長(zhǎng)有菌落，而在后一平板上的相應(yīng)部位卻呈空白，說(shuō)明這就是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株 。 第四步，鑒定缺陷型 ? 生長(zhǎng)譜法 是指在混有供試菌的平板表面點(diǎn)加微量營(yíng)養(yǎng)物，視某營(yíng)養(yǎng)物的周圍有否長(zhǎng)菌來(lái)確定該供試菌的營(yíng)養(yǎng)要求。 ? 鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型的操作是：把生長(zhǎng)在完全培養(yǎng)液里的營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞經(jīng)離心和無(wú)菌水清洗后，配成適當(dāng)濃度的懸液（如 107～ 108個(gè)／ ml），取 ，傾注在培養(yǎng)皿內(nèi)，待凝固、表面干燥后，在皿背劃幾個(gè)區(qū)，然后在平板上按區(qū)加上微量待鑒定缺陷型所需的營(yíng)養(yǎng)物粉末（用濾紙片法也可），例如氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶堿基等。經(jīng)培養(yǎng)后，如發(fā)現(xiàn)某一營(yíng)養(yǎng)物的周圍有生長(zhǎng)圈，就說(shuō)明此菌就是該營(yíng)養(yǎng)物的缺陷型突變株。用類似方法還可測(cè)定雙重或多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 (4)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選舉例 ——枯草桿菌氨基酸缺陷型 菌體前培養(yǎng) 氨基酸缺陷型菌株的營(yíng)養(yǎng)要求的鑒定 細(xì)胞懸浮液制備 誘變處理 中間培養(yǎng) 淘汰野生型 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的檢出 （使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期） （ UV照射 60s） （調(diào)整細(xì)胞濃度為 108個(gè) /ml） （ 30度 CM中振蕩過(guò)夜培養(yǎng)） （青霉素法） （生長(zhǎng)譜法） 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 無(wú)菌水洗下 離心清洗后配成菌懸液（ 107108/ml） [— ] . [+]上生長(zhǎng)的營(yíng) 養(yǎng)缺陷型 培養(yǎng) 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定 ——生長(zhǎng)譜法 ? 作為研究代謝途徑和基因重組等遺傳規(guī)律的標(biāo)記菌種； ? 作為氨基酸、維生素或堿基等物質(zhì)生物測(cè)定的試驗(yàn)菌種； ? 用作發(fā)酵生產(chǎn)核苷酸、氨基酸等代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)菌株；； 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的應(yīng)用 Ames test測(cè)定潛在化學(xué)治癌物 理論依據(jù) ?