微生物的遺傳變異和育種待定(編輯修改稿)
2025-02-10 00:16 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 切酶 酶 II——核酸外切酶 酶 III——DNA聚合酶 酶 IV——DNA連接酶 （一）自發(fā)突變與育種 從生產(chǎn)中育種 定向培育優(yōu)良菌株 （二）誘變育種 二、突變與育種 指 利用物理、化學(xué)等誘變劑處理均勻分散的微生物細胞群，在促進其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合目的的突變株，以供科學(xué)試驗或生產(chǎn)實踐使用。 誘變育種的基本環(huán)節(jié) 誘變育種的原則 突變株的篩選方法 產(chǎn)量突變株的篩選 抗藥性突變株的篩選 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 春日霉素產(chǎn)生菌的孢子懸液 ? 誘變 ? 涂布平板 ? 培養(yǎng) 2天（ 29℃ ） 培養(yǎng) 45天 (29℃ ) 生物鑒定板上含供試菌種 ? 培養(yǎng) 1718小時 (29℃ ） ? 檢查抑菌圈的大小 保持合適的溫、濕度 產(chǎn)量突變株的篩選 ? 抗藥性突變株的篩選 營養(yǎng)缺陷型菌株 ? 營養(yǎng)缺陷型 是指通過誘變產(chǎn)生的，由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長的突變株。 ? 基本培養(yǎng)基（ MM，符號為 []） 是指僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基 (CM，符號為 [+])是指可滿足某種微生物的一切營養(yǎng)缺陷型菌株的營養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。 ? 補充培養(yǎng)基（ SM，符號為 [A]或 [B]等） 是指在基本培養(yǎng)基中添加某種營養(yǎng)物質(zhì)以滿足該營養(yǎng)物質(zhì)缺陷型菌株生長需求的合成或半合成培養(yǎng)基。 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 ? (1)與篩選營養(yǎng)缺陷型有關(guān)的三類培養(yǎng)基 ? 基本培養(yǎng)基 (minimal midium， MM) — [] ? 完全培養(yǎng)基 (plete medium,CM) — [+] ? 補充培養(yǎng)基 (supplemental medium,SM) — [A] ? （ 2） 與營養(yǎng)缺陷型突變有關(guān)的菌體 ? 野生型 (wild type) — 能在 []中生長 ? 營養(yǎng)缺陷型 (auxotroph)— 能在 [+]或 [A]生長 ? 原養(yǎng)型 (prototroph)— 能在 []中生長 抗生素法 菌絲過濾法 青霉素法 制霉菌素法 原菌株 (出發(fā)菌株 ) 誘變劑處理 淘汰野生型 檢出缺陷型 鑒定缺陷型 同一培養(yǎng)皿 夾層培養(yǎng)法 限量補充培養(yǎng)法 不同培養(yǎng)皿 逐個檢出法 影印接種法 生長譜法 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 夾層培養(yǎng)法 夾層培養(yǎng)法 先在培養(yǎng)皿底部倒一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，待凝，添加一層混有經(jīng)誘變劑處理菌液的基本培養(yǎng)基，其上再澆一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，對首次出現(xiàn)的菌落用記號筆一一標在皿底。然后再加一層完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)后新出現(xiàn)的小菌落多數(shù)都是營養(yǎng)缺陷型突變株。 限量補充培養(yǎng)法 ? 限量補充培養(yǎng)法 把誘變處理后的細胞接種在含有微量（＜ %）蛋白胨的基本培養(yǎng)基平板上，野生型細胞就迅速長成較大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型則緩慢生長成小菌落。若需獲得某一特定營養(yǎng)缺陷型，可再在基本培養(yǎng)基中加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 逐個檢出法 ? 逐個檢出法 把經(jīng)誘變處理的細胞群涂布在 完全培養(yǎng)基 的瓊脂平板上，待長成單個菌落后，用接種針或滅過菌的牙簽把這些單個菌落逐個整齊地分別接種到 基本培養(yǎng)基平板 和另一完全培養(yǎng)基平板上，使兩個平板上的菌落位置嚴格對應(yīng)。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基平板的某一部位上長出菌落，而在基本培養(yǎng)基的相應(yīng)位置上卻不長，說明此乃營養(yǎng)缺陷型。 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 影印接種法 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 a b c [] [+] 影印平板法 將誘變劑處理后的細胞群涂布在一完全培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)長出許多菌落。用特殊工具 ——“印章 ” 把此平板上的全部菌落轉(zhuǎn)印到另一基本培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，比較前后兩個平板上長出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)在前一培養(yǎng)基平板上的某一部位長有菌落，而在后一平板上的相應(yīng)部位卻呈空白，說明這就是一個營養(yǎng)缺陷型突變株 。 第四步，鑒定缺陷型 ? 生長譜法 是指在混有供試菌的平板表面點加微量營養(yǎng)物，視某營養(yǎng)物的周圍有否長菌來確定該供試菌的營養(yǎng)要求。 ? 鑒定營養(yǎng)缺陷型的操作是：把生長在完全培養(yǎng)液里的營養(yǎng)缺陷型細胞經(jīng)離心和無菌水清洗后，配成適當(dāng)濃度的懸液（如 107～ 108個／ ml），取 ，傾注在培養(yǎng)皿內(nèi)，待凝固、表面干燥后，在皿背劃幾個區(qū)，然后在平板上按區(qū)加上微量待鑒定缺陷型所需的營養(yǎng)物粉末（用濾紙片法也可），例如氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶堿基等。經(jīng)培養(yǎng)后，如發(fā)現(xiàn)某一營養(yǎng)物的周圍有生長圈，就說明此菌就是該營養(yǎng)物的缺陷型突變株。用類似方法還可測定雙重或多重營養(yǎng)缺陷型。 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 (4)營養(yǎng)缺陷型的篩選舉例 ——枯草桿菌氨基酸缺陷型 菌體前培養(yǎng) 氨基酸缺陷型菌株的營養(yǎng)要求的鑒定 細胞懸浮液制備 誘變處理 中間培養(yǎng) 淘汰野生型 營養(yǎng)缺陷型菌株的檢出 （使細胞處于對數(shù)生長期） （ UV照射 60s） （調(diào)整細胞濃度為 108個 /ml） （ 30度 CM中振蕩過夜培養(yǎng)） （青霉素法） （生長譜法） 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法 無菌水洗下 離心清洗后配成菌懸液（ 107108/ml） [— ] . [+]上生長的營 養(yǎng)缺陷型 培養(yǎng) 營養(yǎng)缺陷型的鑒定 ——生長譜法 ? 作為研究代謝途徑和基因重組等遺傳規(guī)律的標記菌種； ? 作為氨基酸、維生素或堿基等物質(zhì)生物測定的試驗菌種； ? 用作發(fā)酵生產(chǎn)核苷酸、氨基酸等代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)菌株；； 營養(yǎng)缺陷型突變株的應(yīng)用 Ames test測定潛在化學(xué)治癌物 理論依據(jù) ?
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