【文章內(nèi)容簡介】 反應(yīng)體系組成(25μL)成分 填加量Template cDNA5μL10mmol/LdNTPAmy P12μLAmy P210Buffer（MgCl2）Taq DNA Polymerase1μLdd H2O8μL（1）根據(jù)所需濃度(%)，加入2mL 5TBE緩沖液 ，再加18ml蒸餾水放于電爐上使瓊脂糖溶解；（2）溶液冷至60℃時，加入5μLEB混勻；（3）將溶化的瓊脂糖倒入制膠模具。迅速在模具一端插上梳子，檢查有無氣泡；（4）室溫下放置30min45min后，待瓊脂糖溶液完全凝固，小心取出梳子，將凝膠放置于電泳槽中；（5）加入50mL 5TBE電泳緩沖液至電泳槽中，再加入450mL蒸餾水，讓液面高于膠面，這樣凝膠兩端的電壓與外加電壓相等，電泳效率高；（6）在DNA樣品中加入2μL的上樣緩沖液，混勻后，吸取10μL電泳樣品點樣；（7）點樣完畢后，接通電泳槽與電泳儀的電源，由于DNA在中性緩沖液中帶有負電荷，在電場中向正極泳動，所以靠近點樣孔一端接負極。打開電源在電壓100V下進行電泳，待指示劑泳出點樣槽后降低電壓至80V進行電泳；（8）根據(jù)指示劑遷移的位置來斷定是否終止電泳，當指示劑遷移到2/3處時，切斷電源，取出凝膠； （9）將凝膠放在凝膠成像系統(tǒng)儀上檢測電泳結(jié)果，進行照相。（1）在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，裝入離心管中。注意：盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減少凝膠體積，提高回收率。（2）稱量出離心管中凝膠的質(zhì)量，計算出膠塊體積，以1mg=1uL進行計算。 （3）向膠塊中加入3倍體積的膠塊融化液DRI Buffer。（4）均勻混合后在75℃加熱離心管610分鐘使膠塊融化，并要間斷振蕩混合，使膠塊充分融化。注意：膠塊一定要充分融化，否則將會嚴重影響DNA的回收率。（5）向上述膠塊融化液中加入DRI Buffer量的一半體積量的DRII Buffer,均勻混合。（6）將上述溶液轉(zhuǎn)移至已經(jīng)安置好的Spin Column中，12000rpm，離心1分鐘，棄濾液。（7）重復(fù)上面步驟一次。（8）將500μl的Rinse A加入Spin Column中，12000rpm，離心1分鐘，棄濾液。（9）將700μl的Rinse B加入Spin Column中，12000rpm，離心1分鐘，棄濾液。（10）重復(fù)上述步驟。然后將Spin Column安置于新的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入25μl的滅菌蒸餾水，室溫靜置1分鐘后，在12000rpm，離心1分鐘洗脫DNA。（1）感受態(tài)細胞制備：①從保藏的試管中(20℃)挑取大腸桿菌DH5α劃線于LB平板上，在37℃恒溫培養(yǎng)過夜。②挑取單菌落于50mL LB培養(yǎng)基中37℃、200 r/min培養(yǎng)34h，至出現(xiàn)薄霧狀菌懸液即可。③將培養(yǎng)液置于冰上預(yù)冷15min，并間斷輕輕搖動。④將冷卻的培養(yǎng)液倒入己在冰上預(yù)冷的50mL離心管中。⑤在冷凍離心機中離心，4℃ 3000r/min 5min。⑥棄上清、,輕輕旋轉(zhuǎn)，使細胞充分重新懸浮，冰上4℃3000r/min離心5min。⑧棄上清，輕輕旋轉(zhuǎn)，使細胞充分重新懸浮，5min后就可以用于轉(zhuǎn)化實驗，或添加保護劑，低溫或超低溫冷凍貯藏備用。(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：①取出制備好的感受態(tài)細胞，迅速融化放在冰上。②將感受態(tài)細胞分裝成100μL/，質(zhì)粒產(chǎn)物10μL，用微量移液器輕輕吸打均勻、在冰上放置30min。③熱擊 將離心管放置42℃水浴90s(勿動離心管) ④冰浴 快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰上，放置l020min(時間不能太長)。⑤復(fù)蘇 每管加900μL，LB培養(yǎng)基，在37℃ 200r/min振蕩培養(yǎng)5060min,使細菌復(fù)蘇，抗性得以表達。⑥涂皿 取100μL 左右轉(zhuǎn)化液徐布在含有氨芐青霉素(Amp 50μg/mL)的平板上。⑦倒置平板于37℃培養(yǎng)1618h，觀察實驗結(jié)果并記錄結(jié)果6. TA克隆、轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的鑒定(1)連接反應(yīng)體系成分填加量回收純化DNA3μLpGEMT載體1μL10連接緩沖液5μLT4DNA連接酶1μL(2)將連接混合液在16℃溫育4h(3)轉(zhuǎn)化及藍白斑篩選①取出制備好的感受態(tài)細胞，迅速融化放在冰上。②，將上述連接混合液取10μL產(chǎn)物，用微量移液槍輕輕吸打均勻、在冰上放置30min。③熱激 將離心管放置42℃水浴90s(勿動離心管)。④冰浴 快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰上，放置l020min(時間不能太長)。⑤復(fù)蘇 每管加900μL，LB培養(yǎng)基，在37℃ 200r/min振蕩培養(yǎng)5060min。⑥涂皿 取100μL 左右轉(zhuǎn)化液徐布在含有4μL IPTG，40μL xga1和氨芐青霉素(Amp 50μg/mL)的平板上。⑦倒置平板于37℃過夜培養(yǎng)。(4)重組質(zhì)粒的鑒定①酶切鑒定 挑取白色菌落進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA,選取EcoRI進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。酶切體系：37℃ 3h成分填加量質(zhì)粒DNA10μL10Buffer EcoRI酶dd H2O 2μL1μL7μL② PCR鑒定 挑取白色菌落進行培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒DNA，做PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定：PCR體系的反應(yīng)條件：1）94℃ １min 2）94℃ 30s55℃ 45s 30 cycles 72℃ 50s 3）72℃ 10min 4） 4℃ 10min 反應(yīng)體系組成(25μL)成分加入量質(zhì)粒DNA2μL10mmol/LdNTPAmy P12μLAmy P22μL10Buffer（Mg2+）Taq DNA Polymerase1μLdd H2O13μL③測序鑒定挑取白色菌落進行培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒DNA，由上海生工測序，然后進行序列比對。(5)經(jīng)鑒定正確后得到馬鈴薯α淀粉酶的基因,并于4℃保存?zhèn)溆?。（五）畢赤酵母表達載體的選擇、構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的鑒定(1)引物設(shè)計根據(jù)引物設(shè)計的基本原則設(shè)計出帶有NotI位點的引物并由上海生工合成。pMPamyF：5＇GCGGCCGCTAAGGAGATCATATTGCAGGCpMPamyR：5＇GCGGCCGCTCTTCTGCCAGACTGCATAGC(2)引物稀釋將上游引物、下游引物的濃度分別稀釋到10pmol/μL，于20℃保存?zhèn)溆?3)PCR反應(yīng)PCR體系的反應(yīng)條件：①94℃ １min ②94℃ 30s 55℃ 45s 30 cycles72℃ 50s ③72℃ 10min ④ 4℃ 10min 反應(yīng)體系組成(25μL)成分填加量質(zhì)粒DNA2μL10mmol/LdNTPpMPamyF2μLpMPamyR2μL10Buffer（含Mg2+）Taq DNA Polymerase1μLdd H2O13μL(4)反應(yīng)結(jié)束后進行瓊脂糖凝膠電泳并在凝膠成像儀上照相。 (5)PCR擴增正確后回收DNA片段(6)TA克隆、轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的鑒定①TA連接在一支離心管內(nèi)，按照以下順序加入連接混合物成分填加量回收DNA3μLpGEMT載體1μL10連接緩沖液5μLT4 DNA連接酶1μL②將連接混合液在16℃溫育4h③把連接產(chǎn)物做轉(zhuǎn)化④鑒定重組質(zhì)粒的正確性1) 酶切鑒定 挑取白色菌落進行培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒DNA,利用質(zhì)粒多克隆位點內(nèi)的EcoRI位點進行酶切，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。酶切體系：37℃ 3h成分填加量質(zhì)粒DNA10μL10Buffer EcoRI酶dd H2O 2μL1μL7μL2) PCR鑒定 挑取白色菌落進行培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒DNA，做PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定：PCR體系的反應(yīng)條件：（1）94℃ １min（2）94℃ 30s55℃ 45s 30 cycles72℃ 50s（3）72℃ 10min （4） 4℃ 10min 反應(yīng)體系組成(25μL)質(zhì)粒DNA2μL10mmol/LdNTPpMPamyF2μLpMPamyR2μL10Buffer（MgCl2）Taq DNA Polymerase1μLdd H2O8μL⑤鑒定正確后把質(zhì)粒用NotI酶進行酶切酶切體系：酶切條件：37℃ 16h成分填加量質(zhì)粒DNA10μL10Buffer NotI酶dd H2O 2μL1μL7μL⑥酶切正確后回收酶切產(chǎn)物，得到了帶有NotI位點的馬鈴薯α淀粉酶基因2. 酵母表達載體的構(gòu)建、表達及重組質(zhì)粒的鑒定 (1)pPIC9K的構(gòu)建①從以保存pPIC9K菌落平皿上挑取菌落進行培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒DNA，并電泳檢測所提取的質(zhì)粒DNA。②用NotI酶進行酶切提取的正確的質(zhì)粒DNA。③酶切反應(yīng)結(jié)束后對產(chǎn)物進行磷酸化處理，防止自身的環(huán)化而影響和目的基因的連接。酶切體系：37℃ 16h成分填加量質(zhì)粒DNA10μL10Buffer NotI酶dd H2O 2μL1μL7μL ④用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。⑤回收鑒定正確的酶切產(chǎn)物，并在20℃保存?zhèn)溆谩?2)pPIC9K載體和帶有NotI位點的馬鈴薯α淀粉酶基因的重組連接體系：（20μL）成分填加量pPIC9K質(zhì)粒DNA5μL馬鈴薯α淀粉酶質(zhì)粒5μL10連接緩沖液5μLT4 DNA連接酶2μLdd H2O至20μL連接條件：16℃ 24h(3)pPIC9K—αamylase重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(4)挑取單菌落進行培養(yǎng)擴增，提取重組質(zhì)粒DNA.(5)重組質(zhì)粒的鑒定① 酶切鑒定挑取單菌落進行培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒DNA進行鑒定。其余步驟由于時間原因還未完成。三、結(jié)果與分析（一）引物稀釋結(jié)果（1）Amy P1與Amy P2按照說明書分別加入96μL和106μL的DEPC處理水稀釋后，用紫外分光光度計測得的結(jié)果是：Amy P1 OD260 =Amy P2 OD260 =利用公式:引物濃度= OD260稀釋倍數(shù)Ug per OD103106 /分子量pmol/μL,Amy P1濃度=1000103106/=Amy P1濃度=1000103106/= Eppondorf管中稀釋成10pmol/μL的終引物濃度。（2）pMPamyF與pMPamyR按照說明書分別加入96μL和106μL的DEPC處理水稀釋后，用紫外分光光度計測得的結(jié)果是：pMPamyR OD260 =pMPamyF OD260 =利用公式:引物濃度= OD260稀釋倍數(shù)Ug per OD103106 /分子量pmol/μLpMPamyF濃度=100033103106/=pMPamyR濃度=100033103106/= Eppondorf管中稀釋成10pmol/μL的終引物濃度。（二）RNA提取結(jié)果與分析RNA經(jīng)過凝膠電泳后得到的圖片如圖1： 1 228S18S5S 圖1：TotalRNA 凝膠電泳圖像在TotalRNA中含有mRNA、rRNA和tRNA，其中rRNA最多。在電泳圖中可以清楚看到28SrRNA與18SrRNA兩條帶，5SrRNA的條帶不太亮，說明5SrRNA有點降解。28SrRNA帶比18SrRNA帶稍亮。（三）RTPCR結(jié)果與分析PCR凝膠電泳圖片如圖2： M 12000bp1000bp目的產(chǎn)物圖2：PCR凝膠電泳圖像由圖2可以看出在PCR時沒有出現(xiàn)特異性條帶，說明PCR擴增出了專一性的目的片段。（四）馬鈴薯α淀粉酶基因克隆的結(jié)果與分析—αamylase連接結(jié)果轉(zhuǎn)化產(chǎn)物凝膠電泳圖片如圖3： 1 2空載的未重組質(zhì)粒陽性重組質(zhì)粒 圖3：連接產(chǎn)物質(zhì)粒凝膠電泳圖像在圖4中條帶1是提取白色菌落的質(zhì)粒，條帶2是提取藍色菌落的質(zhì)粒。通過對比確定陽性重組質(zhì)粒。用EcoRI酶進行酶切鑒定的凝膠電泳圖片如圖4： 1 2圖4：酶切產(chǎn)物凝膠電泳圖像在圖5中條帶1是轉(zhuǎn)化后的連接質(zhì)粒DNA，條帶2是酶切后的產(chǎn)物。從圖中可以看出連接質(zhì)粒DNA被酶切開了，并且結(jié)果是正確的，所以也可以說把T載體和α淀粉酶基因連接在一起，可以進行下一步實驗。PCR凝膠電泳圖片如圖5： M PCRPCR產(chǎn)物XHANWU2000bp1000bp750bp500bp 圖5：PCR鑒定凝膠電泳圖像圖6說明了所擴增出的片段比1000bp稍大，符合要求克隆基因的大小，所以可以說此質(zhì)粒是正確的連接產(chǎn)物，可以進行下一步實驗。（見附錄二、三）通過對測序報告單的分析及與GenBank中收錄的馬鈴薯α淀粉酶基因序列的比對分析，初步證明所克隆的基因是馬鈴薯α淀粉酶基因，但是部