【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 了依據(jù)。 1972 年 Rlun 等報(bào)道了真菌 β半乳糖苷酶的特性。 進(jìn)入 80 年代，Jrodon 等 [4]首次對(duì)小鼠成功的獲得了動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移，是純合子動(dòng)物分泌的乳汁中完全不含乳糖，為利用基因工程生產(chǎn)低乳糖牛乳奠定了基礎(chǔ)。 國(guó)內(nèi)對(duì) β半乳糖苷酶的研究起步較晚，是在 20世紀(jì) 80年代以后開(kāi)始的。 1980年 天津工業(yè)微生物研究所 [5]組成 β半乳糖苷酶研究組，對(duì) β半乳糖苷酶產(chǎn)生菌的選育、發(fā)酵工藝研究、酶的提取純化、酶學(xué)特性的進(jìn)行了較為全面的研究。 1990年無(wú)錫輕工業(yè)大學(xué)的李強(qiáng)軍等選育到黑曲霉菌 CWL2NU3，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后產(chǎn)酶活 力達(dá) 12u/ml（ ONPG 單位）。 1985 年?yáng)|北農(nóng)業(yè)大學(xué)的萬(wàn)賢生對(duì) β半乳糖苷酶在乳清中的綜合利用展開(kāi)了研究。上海復(fù)旦大學(xué)的郭杰炎等以乳酸酵母 Y121發(fā)酵生產(chǎn)的 β半乳糖苷酶活力達(dá) 40u/ml（ ONPG 單位），干燥制成的酶粉冰箱保藏半年，酶活殘存 98%。 目前， β半乳糖苷酶主要用于低乳糖制品的研制和開(kāi)發(fā)，以滿足乳糖不耐癥患者對(duì)乳制品消費(fèi)的需求。工業(yè) 生產(chǎn) 上最直接、有效的方法就是將酶直接加入到牛乳中制得乳糖水解乳，該法水解條件溫和（ ~8，溫度 50~60℃ ），產(chǎn)物簡(jiǎn)單，不會(huì)破壞乳中的其他營(yíng)養(yǎng)成分。國(guó) 外已有一 些 大公司生產(chǎn)商業(yè)用乳糖酶制劑，用于生產(chǎn)乳糖水解乳制品。 隨著研究的不斷深入，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的 β半乳糖苷酶活性會(huì)進(jìn)一步得到提高。如果在國(guó)內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn) β半乳糖苷酶 的工業(yè)化生產(chǎn)，其制品的生產(chǎn)和應(yīng)用成本將會(huì)大幅度降低。因此， β半乳糖苷酶具有廣闊的市場(chǎng)前景，并且會(huì)取得相當(dāng)可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。 東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 4 β半乳糖苷酶的來(lái)源及其特性 β半乳糖苷酶存在于植物（尤其是杏、桃、蘋(píng)果），細(xì)菌（大腸桿菌、乳酸菌等），真菌（米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、熱帶假絲酵母等），放線菌以及哺乳動(dòng)物（特別是嬰兒）的 腸道中。目前僅來(lái)源于微生物的 β半乳糖苷酶有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，利用微生物發(fā)酵法制取 β半乳糖苷酶，酶源豐富，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低，周期短，而且不受季節(jié)、地 理位置等因素的影響。不同微生物來(lái)源的β半乳糖苷酶 的性質(zhì)有所不同 [6]。 細(xì)菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶 細(xì)菌 β半乳糖苷酶，尤其是嗜熱細(xì)菌產(chǎn)生 的酶正 得到廣泛的研究，到目前為止，大腸桿菌（ Escherichia coli）產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶是研究的最徹底、最深入，并已大量用于生化分析中。細(xì)菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶是 胞內(nèi)酶 ，在培養(yǎng)過(guò)程中不能分泌到培養(yǎng)基中，它 的耐熱性較高，這一點(diǎn)有利于固定化酶的制造。但因產(chǎn)量低及可能的毒性問(wèn)題，故迄今未用于工業(yè)化生產(chǎn)。 酵母菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶 酵母菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶通常是胞內(nèi)酶，制備純品必須破碎細(xì)胞，該酶對(duì)酸、熱較不穩(wěn)定，當(dāng)某些離子存在時(shí)，才有最大活性，因此不適于在工業(yè)上進(jìn)行應(yīng)用。但是，酵母菌容易培養(yǎng)，在深層培養(yǎng)條件下可以大量生產(chǎn) β半乳糖苷酶，這些優(yōu)點(diǎn)掩蓋了它的不足，故酵母菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶才得以成功的進(jìn)行開(kāi)發(fā)。酵母菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶最適 pH 近于中性，與牛乳的天然 pH 值 接近 ，最適溫度較低， 適于 處理牛 乳和甜乳清中的乳糖。脆壁酵母和乳酸酵母（ Saccharimyces lactic）是生產(chǎn) β半乳糖苷酶的主要酵母菌種。 霉菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶 霉菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶是 胞外酶 ，可以用固態(tài)培養(yǎng)也可以采用液態(tài)深層培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)，在培養(yǎng)過(guò)程中酶分泌到培養(yǎng)基中，提取較為方便。霉菌產(chǎn)生的 β半乳第 1 章 緒 論 5 糖苷酶較耐熱、耐酸，不需要活化劑和穩(wěn)定劑，穩(wěn)定性較高。 等人發(fā)現(xiàn)，米曲霉產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶即使在 45℃ 高溫下貯藏 6 個(gè)月，仍能保存其活力的 %。曲霉 β半乳糖苷酶的最適 pH 值較低，適用于 面 包 的制造以 及 分解面團(tuán)中的乳糖 ， 有利于酵母發(fā)酵，并使制品具有良好的色澤。同時(shí)，由于 它 較為穩(wěn)定，有很好的耐受性，比 酵母 β半乳糖苷酶更適合于固定化酶的制造。目前應(yīng)用較多的霉菌 β半乳糖苷酶產(chǎn)生菌主要是米曲霉（ Aspergillus oryzse）和黑曲霉（ Aspergillus niger）。 β半乳糖苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用 水解牛乳和其它乳制品中的乳糖 解決乳糖不耐癥患者的乳品消費(fèi)問(wèn)題 牛乳中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及幾乎全部已知的維生素，尤其是牛乳中含有豐富 的鈣質(zhì)，且極易被人體吸收，被譽(yù)為 “ 近乎完善的食物 ” 。但據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，有 10％的白人， 51％的印第安人， 81％的非裔加勒人和 70％的亞洲人由于腸道內(nèi)缺乏 β半乳糖苷酶而患有程度不同的乳糖不適癥 (又稱(chēng)乳糖不耐癥 )[7]。用 β半乳糖苷酶水解牛乳中的乳糖以滿足乳糖不適癥患者的需要，是較為實(shí)用、有效的方法。采用給患者同時(shí)服用 乳制品和 β半乳糖苷酶片 (通常是霉菌 β半乳糖苷酶 ，它的最適 pH 值與胃環(huán)境相一致 )，也可以解決這一問(wèn)題。 提高乳制品的甜度 乳糖的甜度較低，只有蔗糖 的 20％，水解后，一分子乳糖 生成一分子葡萄糖和一分子半乳糖，可以明顯提高乳制品的甜度，減少甜味劑的用量，而且不增加食品的熱量 [8]。 防止乳制品冷凍時(shí)出現(xiàn)結(jié)晶 乳糖的溶解度較低，只有蔗糖的 10％，在制作冷凍乳制品時(shí)容易結(jié)晶析出，影響產(chǎn)品質(zhì)量。若在加工中添加 25~30％的乳糖水解乳，可防止這類(lèi)質(zhì)量問(wèn)題的東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 6 出現(xiàn) [9]。 在酸乳制作中的應(yīng)用 用 β半乳 糖酶水解乳制作酸乳比使用普通脫脂乳省時(shí)且節(jié)省蔗糖用量，而且能改善酸乳風(fēng)味和口感，延長(zhǎng)酸乳的貨價(jià)期。 在乳清加工中的應(yīng)用 乳清中含有乳清蛋白、乳糖、 礦物質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，其中乳清蛋白是完全蛋白質(zhì)。世界年產(chǎn)量約為 9?107T，其中 50％當(dāng)廢水排放，不僅造成浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。 用 β半 乳糖苷酶將乳清中的乳糖水解，可以提高含乳清飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)去除了乳清濃縮時(shí)乳糖結(jié)晶析出給飼料加工帶來(lái)的不便。此外，用此水解物還可生產(chǎn)乳清飲料、糖漿、食品添加劑等 [10]。 在乳味面包中的應(yīng)用 在乳味面包制作中，添加 β半乳糖苷酶 水解乳，能夠增加面包甜度，提高酵母菌產(chǎn)氣量，使面包更加膨脹，而且水解乳中的半乳糖有利于褐變，改善面包色澤。 生產(chǎn)低 聚半乳糖 (Galactooligosaccharide) 低聚半乳糖是以牛乳或乳清中的乳糖為底物，經(jīng) β半乳糖苷酶催化作用而得到的。低聚半乳糖的熱穩(wěn)定性較好，即使在酸性條件下也是如此，并且具有許多生理功能，如作為雙歧桿菌增殖因子；能促進(jìn)鈣質(zhì)吸收和防止骨質(zhì)減少；有利于促進(jìn)有機(jī)酸生成，降低腸道 pH 值，抑制外源菌的生長(zhǎng)代謝；有利于 B 族維生素產(chǎn)生；低能量；低致齲齒性；改善脂質(zhì)代謝等 [11]。 分析食品中乳糖含量 將精制的 β半乳糖苷酶和其它酶 (如過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶 )聯(lián)合使用可以分析冰淇淋、干酪和含 牛乳的干制品中的乳糖含量。該法簡(jiǎn)便快捷，費(fèi)用低廉，第 1 章 緒 論 7 又可以在樣品不除去蛋白的情況下使用，適合于在食品工業(yè)上進(jìn)行應(yīng)用 [12]。 β半乳糖苷酶在制藥工業(yè)中的應(yīng)用 β半乳糖苷酶是酶類(lèi)藥物，適用于嬰兒各種消化不良癥，如先天性乳糖酶缺乏癥、由胃障礙及缺鐵所致的幼兒慢性腹瀉、幼兒及新生兒腹瀉，由感冒及消化不良等引起的繼發(fā)性腹瀉。加入牛乳中則可防止由牛乳中乳糖不能吸收而引起的乳糖不耐癥。 β半乳糖苷酶在酶聯(lián)免疫反應(yīng) (EIA)中的應(yīng)用 β半乳糖苷酶經(jīng)戊二醛一步標(biāo)記抗人 IgG，建立了 ELISA 測(cè) 定程序，已用于人 IgG、人群破傷風(fēng)抗體、單克隆抗體檢測(cè)，獲得滿意結(jié)果。同時(shí)用于孕酮、皮質(zhì)醇半抗原標(biāo)記，初步建立了該酶的液相競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定程序。近年來(lái)，又報(bào)道了合成該酶的大分子底物，因此， β半乳糖苷酶不僅可用作超微量熒光酶聯(lián)分析，而且還可以在酶放大免疫測(cè)定（ EMIT）和底物標(biāo)記熒光分析中進(jìn)行應(yīng)用（ SLFIA）[13]。第 2 章 材料和方法 8 第 2 章 材料和方法 材料 材料與試劑 菌種來(lái)源：春光乳制品廠附近采集的土壤 鄰硝基苯 βD半乳吡喃糖苷 （ ONPG）分析純 鄰硝基苯酚（ ONP） 分析純 5溴 4氯 3吲 哚 βD半乳糖苷（ Xgal）分析純 二甲基甲酰胺（ DMF）分析純 蛋白胨、乳糖、瓊脂、酵母粉、 NaCl 均為分析純 儀器與設(shè)備 752 型紫 外 /可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京光學(xué)儀器廠 HQZF 全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司 LRH250II 生化培養(yǎng)箱 廣州醫(yī)療設(shè)備廠 PB10 pH 計(jì) Sartorius 0． 20 u m 無(wú)菌濾器 Sartorius zC10 恒溫水浴槽 寧波天恒儀器廠 培養(yǎng)基 分離選擇培養(yǎng)基：蛋白胨 2%，瓊脂 2%， Xgal 20mg/ml，酵 母粉 %，乳糖 2%，%，蒸餾水 100ml， ~,121℃ 高壓蒸汽滅菌 15~30min。 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨 2%，酵母粉 %，乳糖 2%， %，蒸餾水 200ml，pH 自然 。 東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 9 產(chǎn) β半乳糖苷酶菌的篩選 菌株篩選方法 取土樣，稀釋 10 倍，置于 80℃ 水浴鍋中加熱 30min，以去除不產(chǎn)芽孢的菌體。搖床振蕩，使土壤顆粒被打散，混合均勻，用無(wú)菌水將上述溶液稀釋成 1010 10 106梯度，各取 200μL均勻涂布于乳糖篩選平板上， 35～ 40℃ 培養(yǎng)20～ 28 小時(shí)。 分離純化 培養(yǎng)后，挑取 不同形態(tài)的 藍(lán)色菌落，通過(guò)平板劃線進(jìn)行分離純化，重復(fù)三次；對(duì)分離菌株進(jìn)行培養(yǎng)形態(tài)觀察和鏡檢，確定純培養(yǎng)。 菌種生理生化鑒定 在細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)所篩菌株進(jìn)行初步的生理生化鑒定 。 β半乳糖苷酶粗酶液制備 將純化菌株按體積分?jǐn)?shù)為 1％的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中， 37℃ 靜置培養(yǎng) 24h。將培養(yǎng)好的菌液以 5000r/min 離心 10 min，棄掉上清液．沉淀經(jīng)預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌后，在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎。裂解后的菌液 在 4℃ 下以12020r/min 離心 10min，收集上清液，即為粗酶液。 鄰硝基苯酚（ ONP）標(biāo)準(zhǔn)曲線 用檸檬酸 Na2HPO4 緩沖溶液 ()配制 5mmol/ml 鄰硝基苯酚（ ONP）。取 7 支試管分別吸取 0， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 5mmol/ml ONP，補(bǔ)上述緩沖液至 ，然后 40℃ 保溫 15min，加入 2mL ， 1mol/LNaCO3，以第一管為空白，于 420nm 測(cè) 定吸光度，以 ONP 的量為橫坐標(biāo)，以 A420 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 第 2 章 材料和方法 10 β半乳糖苷酶酶活力測(cè)定 取 粗酶液與 濃度為 mol/L 鄰硝基苯 βD半乳吡喃糖苷(ONPG)的 0． 05 mol/L 磷酸鈉緩沖液 (pH 值為 6． 5)混勻， 37 ℃ 反應(yīng) 10 min 后，加入 mL 濃度為 mol/L 的 Na2CO3終止液靜置 5 min，于 420 nm 比色測(cè)定生成鄰硝基苯酚 (ONP)濃度。 1 個(gè)酶活性單位 (u)定義為在 37℃ 下每分鐘分解出1μmol ONP 所需的酶量。 β半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì) 菌種生長(zhǎng)曲線測(cè)定 在篩選平板上挑一單菌落接種于裝液量 30 mL培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中，37℃ 、 225r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，分別于 0、 1 1 2 3 4 60h取樣。每個(gè)處理重復(fù) 3次。以未接種的基礎(chǔ)培養(yǎng)液為空白對(duì)照。測(cè)定菌液的吸光度 OD595 (即生物量 )。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)； OD595為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)物線。 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 將種子菌液以 2％的比例接種到裝有 30 mL基 礎(chǔ)培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中．在 37℃ 、 225 r/min的條件下培養(yǎng)，分別于 0、 1 1 2 3 4 60 h取樣，每個(gè)處理重復(fù) 3次，測(cè)定生物量和 酶活性并繪制曲線。 接種量對(duì)菌株 BGJ222 產(chǎn)酶能力的影響 將種子菌液以 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ％的比例接種到裝有 30 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的 250 mL 的三角瓶中，于 37 ℃ 、 225 r/min 恒溫?fù)u床培養(yǎng) 24 h 取樣測(cè)定 β半乳糖苷酶表達(dá)量，每個(gè)處理重復(fù) 3 次。 pH 值對(duì) β半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響 測(cè)定 β半乳糖苷酶粗酶液在不同 pH 值的濃度為 力，確定 pH 值對(duì) β半乳糖苷酶活力的影響。緩沖液分別為醋酸鈉 (pH 值為 ，東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 11 ， )、磷酸鈉 (pH 值為 ， ， 和 )和 Tris—HCl(pH 值為 ， 和 )，相對(duì)酶活用百分比來(lái)表示。將 β半乳糖苷酶在上述緩沖液中 37℃ 保溫 2 h 和 24h 后，測(cè)殘留的酶活力，分析 pH 值對(duì) β半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響。 溫度對(duì) β半乳糖苷酶活力和