【文章內(nèi)容簡介】 菌種 研究現(xiàn)狀 20 世紀(jì)中期，微生物液體深層培養(yǎng)（發(fā)酵）技術(shù)迅猛發(fā)展，從而形成了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、食品發(fā)酵工業(yè)。 1948 年美國科學(xué)家 Humfeld 等成功地對蘑菇進(jìn)行了液體深層培養(yǎng)，從而揭開了人類進(jìn)行食用菌液體培養(yǎng)和液體菌種研究的序幕，并很快使歐美國家蘑菇生產(chǎn)在五、六十年代快步進(jìn)入了液體菌種和工業(yè)化栽培時代 [9]。近年來，日本 韓國等亞洲國家對香菇、金針菇、平菇液體菌種的研究應(yīng)用已經(jīng)很深入，已有許多菇廠開始用中小型發(fā)酵罐生產(chǎn)液體菌種進(jìn)行栽培。 國內(nèi) 杏鮑菇液體菌種 研究現(xiàn)狀 我國較 早從 事食 用菌 液體 深層 發(fā)酵 研究 的是 上海 植物生 理研 究所孫美聿等人。 1979 年上海師院的楊慶堯教授開始對香菇、金針菇等培養(yǎng)液體菌種，并進(jìn)行栽培試驗。自 80 年代至 20 世紀(jì)來，我國許多科研院所的專家教授前輩開始對食用菌深層發(fā)酵、液體菌種及中小型發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行了反復(fù)、深入和刻苦的研究 ， 為今天我國液體菌種的社會化推廣應(yīng)用，不論在發(fā)酵設(shè)備、工藝技術(shù)還是在栽培應(yīng)用 上，都提供了寶 貴的經(jīng) 驗，奠 定了堅實 的基礎(chǔ) [10]。目前已見的 液體菌種生產(chǎn)與應(yīng)用的食用菌品種，包括平菇、香菇、黑木耳、雙孢菇等常規(guī)品種和白靈 菇、杏 鮑菇、 真姬菇等 珍稀品 種約五 十多個品 種 [11]。但杏鮑菇液體菌種最佳培養(yǎng)周期的研究 4 對于液體菌種存在的保存期短，易失活，易污染，不便運輸?shù)葐栴}，還未見提出有效的解決辦法。雖然有資料表示液體菌種在 04℃ 保存2— 3 個月仍可作菌種，但也有試驗顯示液體菌種 04℃ 保存超過 3天，菌種的生活力就有所下降，萌發(fā)慢，菌袋易污染。 杏鮑菇液體菌種 生產(chǎn)中 存在的問題 液體菌種雖然在栽培上 具有許多優(yōu)點，但目前仍不能 取代固體菌種推廣使用，原因主要有以下 幾 方面 [14]： 1．生產(chǎn)液體菌種的投入比較大。液體菌種生產(chǎn)設(shè)備投資大，一家一戶小規(guī)模生產(chǎn)，購買設(shè)備不劃算；培養(yǎng)設(shè)備需要有電源，而偏遠(yuǎn)農(nóng)村常常停電；液體菌種需要良好的培養(yǎng)環(huán)境，刨造良好的環(huán)境也需要較高的投入。 2．液體菌種生產(chǎn)技術(shù)要求較高，需要專業(yè)的技術(shù)人員管理，才能保證菌種不受污染。一些小型食用菌生產(chǎn)廠家和一般菇農(nóng)很難生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的液體菌種應(yīng)用于生產(chǎn)。 3． 液體菌種菌絲球懸浮于液體培養(yǎng)基中，營養(yǎng)易于吸收，菌絲生長快，老化也快，液體菌種一旦生產(chǎn)出來應(yīng)該及早使用，在接種時間上 缺乏周轉(zhuǎn)余地，一次性投資大。 因此，目前我國液體菌種只在個別大規(guī)模、工廠化的食用菌生產(chǎn)單位使用 ， 而我國目前食用菌生產(chǎn)的現(xiàn)狀是分散的、小規(guī)模的副業(yè)式生產(chǎn)占據(jù)主體，因此科研和生產(chǎn)仍存在著差距，以致成果無法推廣。 研究目的與意義 杏鮑菇的栽培，是以收獲子實體為目的的，并通過市場渠道而獲得經(jīng)濟(jì)效益，菌種雖然不是最終目的，但是重要的中間手段。對杏鮑菇的菌種進(jìn)行液體培養(yǎng)，單位體積液體培養(yǎng)基中生產(chǎn)菌絲速度快，生產(chǎn)量大，只需 4— 5 天即可生產(chǎn)幾升到幾十升甚至更多。生產(chǎn)的液體菌種可以用作栽培用的母種或原種，也可直接作栽 培種。液體菌種在固體培養(yǎng)基上萌發(fā)快、定植早、成品率高。據(jù)報道，把杏鮑菇的液體菌種接到固體培養(yǎng)料中 ，由于液體菌種具有流動性，因而接入的菌種可流散在不 同的部 位萌發(fā) 生長 [15]。 但是液 體菌種 質(zhì)量 是影 響萌發(fā)出河南科技大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（論文） 5 菇的關(guān)鍵因素之一 ，采用質(zhì)量好的菌種無疑能提高出菇產(chǎn)量。 液體菌種培養(yǎng)時間短則菌種活力不足，培養(yǎng)時間 長則菌種老化，所以確定適宜的培養(yǎng)周期非常關(guān)鍵。 2 試驗材料與方法 試驗材料 供試菌種 杏鮑菇菌株，由河南科技大學(xué)提供。 設(shè)備儀器 電熱鼓風(fēng)干燥箱， 霉菌培養(yǎng)箱 ， 立式電 ， 熱壓力蒸汽滅 菌器， 雙數(shù)顯汽浴恒溫振蕩器，離心機(jī)，分光光度計。 所需藥品 葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，維生素 b，蒸餾水 , 醋酸，醋酸鈉，羧甲基纖維素鈉，可溶性淀粉，酒石酸鉀鈉， 3， 5二硝基水楊酸，苯酚，氫氧化鈉，磷酸氫鉀，鄰聯(lián)甲苯胺 ，鄰苯二酚等。 實驗用具 80 目篩網(wǎng)，電磁爐， 250ml 三角瓶，試管，燒杯，吸管，培養(yǎng)皿，玻璃棒，量筒，溫度計，試管架， 100ml 容量瓶， 500ml 容量瓶，比色皿等。 試驗試劑及配制 %可溶性淀粉溶液（ 、 ）； %的羧甲基纖維素鈉溶液（用 ph=、 制）； ， ph= 的磷酸鹽緩沖液； ， ph= 的醋酸緩沖液。 試管培養(yǎng)基：采用 PDA 培養(yǎng)基 ， 馬鈴薯 200 克， 葡萄糖 20 克，瓊脂 15 克，自來水 1000 毫升，自然 pH。配制方法：現(xiàn)將馬鈴薯洗凈去皮， 再稱取 200g 馬鈴薯切成小塊， 加水煮爛。用四層紗布過濾，杏鮑菇液體菌種最佳培養(yǎng)周期的研究 6 加熱，再據(jù)實際實驗需要加瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂融完后，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補足水分至 1000 毫升，分裝試管，加塞，包扎，滅菌 20 分鐘取出，試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩? 試驗培養(yǎng)基：采用 黃豆粉培養(yǎng)基 [16]， 黃豆粉 30g，葡萄糖 15g，蛋白胨 1g, 磷酸二氫鉀 ， 硫酸鎂 ， 維生素 b 5mg， 水 500ml。配制方法如下：將 黃豆粉 加水煮沸 30min 后，用 80 目的篩網(wǎng)過濾，取其濾液，加入其他成分，補足水分，分裝在 250ml 的三角瓶中 ， 121℃ 濕熱滅菌 30min。 一級菌種的制備 ： 母種活化將保存的菌種轉(zhuǎn)接到無菌的斜面培養(yǎng)基上，放入 25℃ 左右恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 7— 10 天，得到斜面母種。取 左右的母種菌塊接種于裝有 150ml 一級培養(yǎng)基的 250ml 三角瓶中，每瓶 3 塊， 25℃ 下靜置 2 天，然后在溫度 25℃ 、轉(zhuǎn)速150r/min，振蕩培養(yǎng) 5 天 [17]。 一級搖瓶培養(yǎng)基：葡萄糖 30g，蛋白胨 2g，瓊脂 4g， 磷酸二氫鉀， 硫酸鎂 ， VBl10mg，水 1000ml， 121℃ 滅菌 20分鐘 [18]。 二級菌 種的制 備 ： 將一級 菌種 按試驗 要求 接種于 裝有二 級培養(yǎng)基的 250ml 三角瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)，溫度 25℃ 、轉(zhuǎn)速 120r／ min。 DNS 試劑配制 ：酒石酸鉀鈉 ，溶于 50ml 蒸餾水中，加熱，于熱溶液中依次加入 3， 5二硝基水楊酸 ， ，苯酚 ，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至 100ml，貯于棕色瓶中，室溫保存。但是一定要注意， 3， 5二硝基水楊酸和 NaOH 的加入時間一定要很近，或者是先加入 NaOH。否則會產(chǎn)生難溶的沉淀，導(dǎo)致配制溶液失敗。且配置過程中，溶液加熱溫度不宜超過 50℃ 。 測定方法 菌球直徑的 測定 取 lml 培養(yǎng)液放入培養(yǎng)皿中，按 lml培養(yǎng)液含菌球大小的數(shù)量比，取 20 個菌球在培養(yǎng)皿中排成一列，測總長度，然后計算單個菌球直徑，取 3 次求平均值 [19]。 曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標(biāo) ， 菌球直徑（ mm）為縱河南科技大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（論文） 7 坐標(biāo)，繪制曲線。 菌球密度的測定 將培養(yǎng)好的液體菌種搖勻后，取 lml培養(yǎng)液于培養(yǎng)皿中， 培養(yǎng)皿下墊方格紙 直觀計數(shù)，取 3次求平均值。 曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標(biāo) ， 菌球密度（個）為縱坐標(biāo)，繪制曲線。 淀粉酶活性的測定 在試管加入 %可溶性淀粉溶液（ 、 沖液） ，再加入稀釋 10 倍粗酶液 ，混勻，于 38℃ 水浴保溫 30min，取出后立即加入 DNS 試劑 ，煮沸 5min 后取出，冷卻后加入蒸餾水 ，混勻，測 520nm 處 OD 值，以煮沸滅活 15min的酶液作對照 [ 20]（設(shè)置三個重復(fù)）。 曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標(biāo) ， 淀粉酶活性 OD 值 為縱坐標(biāo)，繪制曲線。 羧甲基纖維素酶（ CMC 酶）活性的測定 在試管中加入 %的羧甲基纖維素鈉溶液（用 ph=、） ，加稀釋 10 倍的粗酶液 ，50℃ 水浴保濕 10min，取出后立即加入 DNS 試劑 ，煮沸 5min，取出，冷卻后加入蒸餾水 ，混勻，測 520nm 處的 OD 值，以煮沸滅活 15min 的酶液作對照（設(shè)置三個重復(fù)）。 曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標(biāo) ， 羧甲基纖維素酶（ CMC酶）活性 OD 值 為縱坐標(biāo)，繪制曲線。 多酚氧化物酶活性測定 先往試管中加入 ， ph= 的磷酸鹽緩沖液 ，再加入 ，再加稀釋 10 倍的 粗酶液 ，28℃ 保溫 30min，測 400nm 處 OD 值，以煮沸滅活 15min 的酶液作對照（設(shè)置三個重復(fù)）。 曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標(biāo) ， 多酚氧化物酶 OD 值為縱坐標(biāo)，繪制曲線。 杏鮑菇液體菌種最佳培養(yǎng)周期的研究 8 漆酶活性的測定 先往試管中加入 ， ph= 的醋酸緩沖液 ，再加入 ，再加入稀釋 10 倍的粗酶液 ，保溫 30min，測 600nm 處光密度（ OD 值），以煮沸滅活 15min 的酶液作對照（設(shè)置三個重復(fù)）。 曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標(biāo) ， 漆 酶 OD 值 為縱坐標(biāo)，繪制曲線。 培養(yǎng)基 pH 的測定 用玻璃棒蘸取少量培養(yǎng)基浸濕精密 pH 試紙，與標(biāo)準(zhǔn)比色卡對比讀數(shù)。（設(shè)置三個重復(fù)）。 曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標(biāo) ， 培養(yǎng)基 pH 為縱坐標(biāo)，繪制曲線。 數(shù)據(jù)處理 采用 Excel 等統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析。 3 結(jié)果與分析 不同培