【正文】 養(yǎng)成苗的基因型，如坷字2031冀合321等 [56]。其成功的關鍵有兩點：①選用胚性愈傷組織作為游離棉花原生質體的起始物，這樣就保證了游離得到的原生質體的生活力，使其細胞易于持續(xù)分裂并具有極高的植株再生能力；②選用易于培養(yǎng)的基因型。隨后魏良民（1996） [54]以海島棉無菌苗的下胚軸為外植體，誘導產生愈傷組織，挑選愈傷組織建立懸浮培養(yǎng)胚性細胞，9原生質體再生細胞系經幾次分裂后產生再生細胞團。如何制備和篩選分裂能力和胚狀體發(fā)生能力強的原生質體，如何創(chuàng)造合適的培養(yǎng)條件是解決這些問題的關鍵。棉花原生質體培養(yǎng)獲得成功的關鍵在于獲得大量再生植株，而獲得大量再生植株十分困難。原生質體培養(yǎng)具有重要的意義，它的發(fā)展和植株再生的成功為開展細胞再生基礎理論研究、體細胞雜交、單細胞變異體篩選、突變育種和遺傳操作等奠定了基礎。通過胚珠培養(yǎng)可使某些遠緣雜種的成胚率呈數倍增長 [52]（張獻龍等，1988） 。為克服中間雜交不親和性提供了成功的試驗技術，同時探討了種間雜交不親和性的生理生化機理。③克服種間雜交不親和。②研究寄主病原菌的相互作用。楊佑明等 [49]（2022）針對傳統(tǒng)的棉胚珠培養(yǎng)方法因纖維在發(fā)育中途夭亡而不能用于研究次生壁增厚和強度形成的機理，建立了棉胚珠繼代培養(yǎng)纖維體系，即根據花鈴的形態(tài)特征選?、蝾惏l(fā)育狀態(tài)的胚珠作外植體，14天為周期連續(xù)3次繼代，在繼代培養(yǎng)基中添加 5g/L 活性碳，并根據纖維發(fā)育不同階段的特點，調整植物生長物質的種類和濃度。1971年Beasley [48]首次報道從陸地棉（Gossypium hirsutum L.）胚珠的珠孔端誘導出愈傷組織。截止目前，在棉花體細胞培養(yǎng)再生植株的研究中應用的外植體主要是：胚珠、原生質體和花藥三種。該植株再生方式嚴重依賴于基因型，并且周期長、畸形率高，影響因素較多。從上述可知，棉花體細胞胚發(fā)生植株再生研究報道的很多，發(fā)展迅速。棉花體細胞胚發(fā)生植株再生技術是進行其原生質體融合、創(chuàng)造雜種植株的必要條件，同時是進行其抗性研究、遺傳變異篩選、基因轉化、棉纖維發(fā)育研究的良好實驗系統(tǒng)。新型植物激素 BR 與 2,4D 并用時，可使難以誘導胚胎發(fā)生的品種“河南 79” 胚胎發(fā)生。張獻龍等 [41]（1991）以陸地棉品種珂字 201 為材料，研究了基本培養(yǎng)基中添加多種激素對體細胞胚胎發(fā)生的影響。Gawel N J 等 [35,36]也從陸地棉的葉、葉柄等成熟器官愈傷組織得到了再生植株。不久，Davidonis 等 [33]（1965 ）報道陸地棉品種珂字 310 的子葉愈傷組織在改良 Linsmaier 和 Skoog 培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng) 2 年后得到再生植株，但實驗周期長，可重復性差。 棉花組織培養(yǎng)植株再生研究進展 體細胞培養(yǎng)及其應用70 年代末，Price 和 Smith[31]首次報道從克勞茨基棉細胞懸浮培養(yǎng)中得到胚狀體，7雖一直未培養(yǎng)成苗，但這一研究為獲得再生棉花植株奠定了基礎。轉基因植物技術及其產品是當今世界農業(yè)生物技術研究與產業(yè)化開發(fā)的重點和熱點，是我國農業(yè)科技革命的核心內容之一，對我國農業(yè)科技手段的更新?lián)Q代以及農業(yè)產業(yè)結構的調整具有重要的戰(zhàn)略意義 [29]。與現有的植物物種相比，轉基因植物具有更強的抗病蟲能力和抗逆境脅迫能力、更高的產量、更優(yōu)的營養(yǎng)等優(yōu)點。其他方面的應用還有雜種優(yōu)勢新品種的培育、生物反應器生產藥物等 [26,27]。該工程是目前植物轉基因技術研究的一項熱點，主要包括植物蛋白品質改良、碳水化合物（如淀粉、糖等）品質改良；脂肪、維生素品質改良以及后熟品質改良等。如已進入商業(yè)化生產的 Bt 轉基因抗蟲棉、抗草甘膦大豆、抗蟲轉基因玉米等等。該工程是一項研究最早，技術最為成熟，而且應用規(guī)模最大的植物轉基因技術。大量轉基因植株的研究表明其在作物育種上具有以下特點：①植物基因工程是在基因水平上來改造植物的遺傳物質，更具有科學性和精確性；②定向改造植物遺傳性狀，提高了育種的目的性和可操作性；③大大地擴展了育種范圍，打破了物種之間地生殖隔離障礙，實現了基因在生物界地共用性，豐富了基因資源；④集現代新技術為一體，如 DNA 重組技術、分子雜交技術、細胞培養(yǎng)技術、基因轉化技術、及基因表達調控技術等等，使育種途徑進入一個高新技術時新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉化影響因素的研究6代 [25]。用于定向創(chuàng)造植物新類型的基因工程技術稱為植物轉基因技術，這一技術打破了生物的種間隔離，大大擴大了物種之間的基因交流范圍，所產生的植物新類型稱為轉基因植物，這種遺傳物質經過改造的植物在性狀、營養(yǎng)和消費品質等方面可以向人類需要的目標轉變。 植物基因工程概述、應用及發(fā)展概況 植物基因工程概述植物基因工程是有目的地將外源 DNA 導入植物，使之整合、表達并能穩(wěn)定遺傳的技術。這些技術的建立不論是在植物的品種改良、植物種質保存、植物突變體的篩選、植物快速繁殖、植株脫毒及植物產品的生產方面，還是在為植物基因工程創(chuàng)造前提條件等方面都發(fā)揮著重要作用 [20]。繼代有利于減輕褐化情況，但繼代次數過多玻璃化頻率提高 [21,22]。繼代次數對組培苗的生根、外植體褐變和試管苗褐化等都有一定的影響。溫度對植株的生長也有一定的影響。光周期由植株的生理特性決定，以16h光照居多，24h或12h光照也有報道。生長素主要促進細胞分裂、誘導愈傷組織產生和促進生根等，常用的有NAA、IBA和2,4D。培養(yǎng)基的pH 值還可以通過影響培養(yǎng)物的營養(yǎng)元素的吸收過程來影響呼吸代謝、多胺代謝與脫氧核糖核酸合成、植物激素進出細胞等作用，進而直接或間接的影響愈傷組織的形成及形態(tài)建成 [20]。～%，瓊脂本身不提供任何營養(yǎng)，僅起到支持培養(yǎng)物的作用，但瓊脂的用量需適當，瓊脂濃度過高會使培養(yǎng)物不能與培養(yǎng)基緊密接觸，不能很好的吸收養(yǎng)分而變黃，濃度過低試管苗水勢高，玻璃化現象嚴重。植株的基因型起決定性作用，不同基因型的植株其再生能力有很大差別，通常幼嫩植株的芽比成熟植株的再生能力強，這可能是幼嫩植株分生能力旺盛的結果 [19]。 植物組織培養(yǎng)技術的影響因素理論上每一個植物細胞都具有再生成完整植株的能力，即細胞全能性?！?直接體細胞胚發(fā)生再生植株方式（不經歷愈傷組織階段）： 外植體 體細胞胚 完整植株 ● 間接體細胞胚發(fā)生再生植株方式（經歷愈傷組織階段）： 脫分化 再分化 外植體 愈傷組織 胚性愈傷組織 體細胞胚 完整植株② 器官發(fā)生植株植株再生途徑：培養(yǎng)的植物組織或細胞通過誘導形成根、芽等器官再生成完整植株。因此，培養(yǎng)的植物組織或細胞可以通過誘導根、芽等器官形成，或通過體細胞胚發(fā)生途徑，兩條途徑經歷或不經歷愈傷組織中間形式而實現植株再生 [1518]。愈傷組織即為典型的脫分化的組織。在絕大多數的情況下，植物細胞全能性的表達要經過一個從分化狀態(tài)到脫分化的愈傷組織的中間形式，然后進入再分化和再生的階段，但也有的在植物組織中直接發(fā)生脫分化和再分化的過程，而不需經歷愈傷組織的中間形式。 植物組織培養(yǎng)再生植株途徑及方式盡管已確立了植物細胞全能性的理論，但實踐上，全能性表達的難易程度在各種植物，甚至在同一植物，同一組織的不同細胞之中都有很大的差別。此后又證實了胡蘿卜單一的細胞亦具有這種能力。其中 50 年代，F. Skoog，F. C. Steward 及其他的一些學者確定了植物組織生長所必須的營養(yǎng)成分，設計了許多適合各種植物組織培養(yǎng)的有效配方，如 MS、 B5 、N 6 、 SH 等，使植物的外植體培養(yǎng)在適宜的培養(yǎng)基上形成脫分化而待分化的細胞團—愈傷組織，Skoog 等人又證實了改變培養(yǎng)3基中的植物生長調節(jié)物質（生長素和分裂素）相對濃度可使煙草愈傷組織分化出苗或根。在一個完整植株上，某部分的體細胞只表現一定形態(tài)、行使一定的功能，這是由于它受到具體器官或組織所在環(huán)境的束縛，但其遺傳潛力并沒有喪失；一旦脫離其原來的器官或組織影響，如處于離體狀態(tài)，在一定的培養(yǎng)條件下，就可能表現出全能性，并發(fā)育成完整植株。在植物的生長發(fā)育中，從一個受精卵分裂到產生具有完整形態(tài)和結構機能的植株，這是該受精卵具有該物種全部遺傳信息的表現。 植物組織培養(yǎng)的基本理論植物組織細胞培養(yǎng)的理論基礎是建立在細胞學說和細胞的全能性的概念上。從應用上來看，可以分成兩個方面：一類是與遺傳改良直接有關的技術（原生質體培養(yǎng)與融合、染色體工程、基因工程等） ；另一類是與繁殖有關的間接的技術（如微體繁殖） ，它們對作物育種都有著重要作用。目前，這一技術已成為一門精細的實驗科學，所建立的成套標準操作程序已在實踐中得到廣泛應用，特別是在快速繁育名貴花卉、果木、樹木、蔬菜、藥用植物和農作物等方面都已取得了顯著的經濟效益和社會效益。由于培養(yǎng)的對象大多是脫離植物母體的外植體，培養(yǎng)的器皿一新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉化影響因素的研究2般是在試管內，所以植物組織培養(yǎng)也叫離體（體外）培養(yǎng)（culture in vitro）或試管培養(yǎng)（culture in testtube） [6,7]。同時，.隨著基因工程技術的發(fā)展，植物組織培養(yǎng)又為植物遺傳轉化奠定堅實技術基礎，對培養(yǎng)抗病蟲害、抗逆、高產、優(yōu)質的作物新品種正發(fā)揮著巨大潛力和作用，其應用必將使作物育種工作在原有傳統(tǒng)技術基礎上進一步朝著精確化、高效化的方向發(fā)展 [5]。為了加快育種速度，利用高新技術，將抗蚜蟲基因、抗黃萎基因、抗旱基因、抗鹽堿基因構建轉化到棉花品種中的研究越來越受到科學研究者的關注。如今新疆棉花生產既是新疆的重要經濟支柱，也是穩(wěn)定國家棉花供應的重要保障。新疆作為我國特大型的優(yōu)質商品棉基地，由于自然條件得天獨厚，越來越顯示出其重要性。新疆隸屬西北邊陲，西北內陸棉區(qū)主要就是指新疆棉區(qū) [1]。我國是世界上最大的棉花生產國和消費國，在農業(yè)生產及整個國民經濟中棉花具有重要的作用。 geic transformation 新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉化影響因素的研究VI目 錄第一章 文獻綜述 ................................................1 植物組織培養(yǎng)理論基礎、應用及發(fā)展概況...................................1 植物基因工程概述、應用及發(fā)展概況.......................................5 棉花組織培養(yǎng)植株再生研究進展...........................................6 遺傳轉化研究在棉花育種上的應用........................................11 GFP 報告基因的檢測....................................................19 本研究的目的和意義....................................................19第二章 材料和方法 ............................................21 試驗材料..............................................................21 試驗方法..............................................................21第三章 結果與分析 .............................................29 上胚軸外植體的多芽誘導................................................29 不同激素組合對多芽誘導的影響..........................................32 培養(yǎng)基中添加 IBA 對生根的影響..........................................34 培養(yǎng)條件對棉花遺傳轉化的影響..........................................35 GFP 基因的檢測........................................................39 討論..................................................................40第四章 結論 ..................................................42本研究論文創(chuàng)新點 ..............................................43參考文獻 ......................................................44附錄――縮略詞表 ..............................................50VII致謝 ..........................................................51個人簡介 ......................................................521第一章 文獻綜述棉花（Gossypium hirsutum L. and L.）是重要的經濟作物。 direct anogenesis。關鍵詞：棉花；上胚軸及