【正文】 生物熒光素蛋白是指存在于生物體的，能在激發(fā)光作用下發(fā)射出熒光的蛋白質(zhì)。該技術(shù)的建立開創(chuàng)了整株植物活體基因轉(zhuǎn)化的新途徑，經(jīng)過多年來不斷的研究和改進(jìn)，該技術(shù)日趨成熟，在我國(guó)棉花轉(zhuǎn)基因育種研究中發(fā)揮著重要作用 [135138]。之后，我國(guó)學(xué)者通過此方法陸續(xù)將BT、BT+CpTI，SGNA等基因?qū)胫袊?guó)主栽棉花品種中，目前已育成許多轉(zhuǎn)基因品種（系）?；ǚ酃芡ǖ擂D(zhuǎn)基因技術(shù)首先由我國(guó)科學(xué)家提出并在許多作物遺傳轉(zhuǎn)化中取得了成功，由于這一工作在初期階段是以總 DNA 為外源基因供體，雖能引起后代發(fā)生變異，但對(duì)外源 DNA 進(jìn)入胚囊、卵細(xì)胞或受精卵導(dǎo)致核基因組或細(xì)胞質(zhì)基因組的行為及整合機(jī)理，以及引起特定而廣泛變異的機(jī)制和轉(zhuǎn)化后的表達(dá)與調(diào)節(jié)等問題缺乏理論上的確切認(rèn)識(shí)，致使國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)其可靠性提出了質(zhì)疑。在進(jìn)入胚囊的途徑中，自顯斑點(diǎn)主要集中顯現(xiàn)在珠心孔道內(nèi)，即花粉管通道，在花粉管通道以外的珠心組織無標(biāo)記顯示，表明授粉后形成的花粉管通道是外源 DNA 進(jìn)入胚囊的天然的唯一途徑。 花粉管通道轉(zhuǎn)化法的在棉花上的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用利用花粉管通道法實(shí)現(xiàn)棉花遺傳轉(zhuǎn)化是外源 DNA 直接導(dǎo)入植物體成功的例子之一。王關(guān)林等 [25]認(rèn)為，裸露的外源DNA 直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化過程中進(jìn)入受體細(xì)胞的外源 DNA 拷貝數(shù)較多，整合到植物細(xì)胞基因組的拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)也較多，外源 DNA的結(jié)構(gòu)變化復(fù)雜，在受體細(xì)胞中的遺傳穩(wěn)定性較差，但已經(jīng)整合到植物基因組的外源 DNA一般都能穩(wěn)定遺傳，只是遺傳規(guī)律性較差。通常轉(zhuǎn)化率為1%～10% 。研究表明，由外源 DNA 直接導(dǎo)入所引起的性狀變異，涉及棉花的各類質(zhì)量和數(shù)量性狀，包括植株形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育、生理生化、抗性、產(chǎn)量構(gòu)成等各個(gè)方面，一般變異性狀在第三或第四代就能夠穩(wěn)定，大大縮短了育種進(jìn)程。不足之處是外源 DNA 隨機(jī)整合新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究18到棉花染色體基因組，轉(zhuǎn)化植株后代遺傳復(fù)雜；轉(zhuǎn)化的時(shí)間受自然花期限制；在田間進(jìn)行操作，受環(huán)境條件的影響很大，因此，操作的經(jīng)驗(yàn)性很強(qiáng)，需要一定的技術(shù)摸索和技巧。花粉管通道轉(zhuǎn)化法適宜范圍廣，受體類型廣泛，不受基因型限制。注射前，摘去花瓣，抹平花柱，而后用微量加樣器沿子房的縱軸方向垂直進(jìn)針，DNA用量和濃度因總 DNA 或質(zhì)粒 DNA 而不同，總 DNA 用量較多，每次注射1～20uL ，質(zhì)粒 DNA 用量較少，每次注射 ～10uL。棉花為大花、多胚珠、大子房，一般采用幼子房微注射法。外源 DNA 片段進(jìn)入受體，整合是隨機(jī)的，可能整合到結(jié)構(gòu)基因中，也可能通過調(diào)控基因或重復(fù)序列方式發(fā)揮作用 [128]。雖然進(jìn)化中同時(shí)存在著相當(dāng)強(qiáng)的保守性，但生物的主要基礎(chǔ)代謝，如糖、氨基酸、能量代謝、蛋白質(zhì)和核酸的生物合成與分解等都是共有的（如有90%以上的已知酶在各種生物中都是共有的）。從整體上說，遠(yuǎn)緣親本間的染色體結(jié)構(gòu)是不親和的。周光宇等結(jié)合我國(guó)遠(yuǎn)緣雜交的成功經(jīng)驗(yàn)，提出了遠(yuǎn)緣雜交中存在 DNA 片段雜交的假設(shè) [126,127]，其主要內(nèi)容是，授粉后外源 DNA 能沿著花粉管經(jīng)過的珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞從而參與到新形成的種子中。因此，如何提高轉(zhuǎn)化率是有待解決的核心問題，國(guó)內(nèi)外的研究主要圍繞轉(zhuǎn)化前受體材料類型、滲透處理 [121123]、多莖尖誘導(dǎo)及劈開分生組織暴露出敏感層等，研究和提高外植體的接受能力及外植體的數(shù)量，同時(shí)研究轟擊后細(xì)胞的恢復(fù)調(diào)整和梯度篩選強(qiáng)度等，以提高植株再生效率，優(yōu)化轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，進(jìn)而提高基因槍轉(zhuǎn)化率 [124,125]。到目前，使用基因槍進(jìn)行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化不過十幾年的時(shí)間，還有許多問題需要進(jìn)一步研究。John [112]等第一次將此技術(shù)應(yīng)用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化中，以胚性懸浮細(xì)胞系為受體進(jìn)行轟擊，成功得到轉(zhuǎn)化植株；之后，McCabe [ 113]、Caryl [114]、吳敬音 [115]、朱衛(wèi)民 [116]等以莖尖分生組織為受體、郝秀英等 [117]以棉花下胚軸為受體，Rajasekaran [118]等用胚性細(xì)胞懸浮系為受體均獲得了抗性轉(zhuǎn)化植株。剛剛恢復(fù)過的受傷細(xì)胞通常采用梯度篩選法，即篩選濃度應(yīng)遵循濃度由低漸高的抗性篩選過程，梯度篩選法起始濃度是很重要的，過低會(huì)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化周期；過高又會(huì)嚴(yán)重降低抗性植株轉(zhuǎn)化率 [111]。應(yīng)選用具有較強(qiáng)分生能力的細(xì)胞、幼嫩的組織、幼胚、莖尖等為外植體，并進(jìn)行預(yù)滲透培養(yǎng)處理等使受體處于感受態(tài)等，以利于提高轉(zhuǎn)化率。生物因素主要是指轉(zhuǎn)化體系和培養(yǎng)程序。物理因素：微彈理化性質(zhì)及其大小、團(tuán)聚性、分散性對(duì)轉(zhuǎn)化效果有一定程度的影響；DNA 沉淀劑，常用的 DNA 沉淀劑有Ca 2+ 、亞精胺等，這些化合物的濃度對(duì) 新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究16DNA 在微粒上的粘附和植物受體細(xì)胞的傷害均有重要作用；DNA 的純度、濃度及微彈速度，其中微彈速度是影響轉(zhuǎn)化率的一個(gè)重要因素，它直接決定了微彈對(duì)細(xì)胞和組織的作用力及產(chǎn)生損傷的程度。不足之處為基因槍轉(zhuǎn)化體系外源基因整合位點(diǎn)較多，多拷貝比例相對(duì)較高，嵌合體比例較高，易出現(xiàn)共抑制和基因沉默現(xiàn)象，遺傳穩(wěn)定性較差 [110]。③可控度高，重復(fù)性好。②靶受體類型廣泛。 基因槍轉(zhuǎn)化法的技術(shù)特點(diǎn)及影響轉(zhuǎn)化率的因素應(yīng)用基因槍技術(shù)轉(zhuǎn)化棉花有以下特點(diǎn)：①無宿主基因型限制，受體類型廣泛。其粒子速度主要是通過火藥的數(shù)量及速度調(diào)節(jié)器控制；第2類是以高壓氣體作為動(dòng)力，如以氦氣、氫氣、氮?dú)獾?；?類是以高壓放電為驅(qū)動(dòng)力，其最大優(yōu)點(diǎn)是可以無級(jí)調(diào)速，通過變化工作電壓，粒子速度和射入濃度可準(zhǔn)確控制。美國(guó)Cornell大學(xué)的John Sanford等 [109]于 1987年研制出火藥引爆（ Gunpower）的基因槍。其基本原理是將外源 DNA 包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓作用下將微粒高速射入受體組織或細(xì)胞，微粒上的外源 DNA 進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物基因組上，并得到表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化 [108]。國(guó)內(nèi)外利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已將 BtCpTAP 等抗蟲基因，tfdA，Bt，aroA等抗除草劑及抗黃萎病、立枯病15等許多有價(jià)值的目的基因?qū)朊藁?，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，且獲得的部分轉(zhuǎn)基因棉花已進(jìn)入大田，進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn) [105107]。1987年Umbeck 等 [103]人將 NPTⅡ 和 CAT 基因?qū)腌孀?12，獲得轉(zhuǎn)基因再生棉株。 目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的研究熱點(diǎn)及應(yīng)用概況目前，利用農(nóng)桿菌進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化的研究主要集中在：基因的高效啟動(dòng)和表達(dá)[100,101]；農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的改進(jìn)和優(yōu)化，即優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化的體細(xì)胞再生體系，縮短轉(zhuǎn)基因植株的再生周期，通過調(diào)整培養(yǎng)基成分、固化劑濃度及激素水平，改善體胚成熟、分化、生長(zhǎng)的條件，減少畸形苗、變異系的發(fā)生 [102]。侵染外植體的農(nóng)桿菌采用LBA4404菌株較好，在侵染前要經(jīng)過活化、～，侵染時(shí)間一般為5～15min，共培養(yǎng)時(shí)間24～36h。再有，農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率與棉花品種的基因型、外植體類型、共培養(yǎng)時(shí)間、再生體系的建立等一系列因素有關(guān)。②農(nóng)桿菌培養(yǎng)溫度，當(dāng)溫度過高超過30℃，將發(fā)生質(zhì)粒丟失；溫度超過28℃，質(zhì)粒致毒區(qū)vir基因不活化，不發(fā)生轉(zhuǎn)化。此外,不同菌種Vir基因的誘導(dǎo)效果還與誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH有關(guān)。其他物質(zhì)對(duì)Vir基因有誘導(dǎo)作用,如肌醇、非代謝糖類（2脫氧葡萄糖、6 脫氧葡萄糖等） 。同樣，在共培養(yǎng)時(shí)間短、難以誘導(dǎo)Vir基因表達(dá)的情況下,酚類物質(zhì)的使用可能會(huì)產(chǎn)生良好的效果 [93,94]。新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究14目前廣泛使用乙酰丁香酮、羥基乙酰丁香酮及植物細(xì)胞培養(yǎng)液來誘導(dǎo)農(nóng)桿菌，并在一些轉(zhuǎn)化中取得好的轉(zhuǎn)化效果 [91,92]。目前，一般首先將目的基因?qū)艘自偕蛐停賹⒅c優(yōu)良栽培品種雜交、回交，選擇適宜的材料育成品種。但是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)受到農(nóng)桿菌宿主專一性的限制，農(nóng)桿菌對(duì)某些品種的感染效率很低，而且與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的外植體須經(jīng)過愈傷組織、胚胎發(fā)生，最后形成再生植株，獲得轉(zhuǎn)基因植株所需時(shí)間較長(zhǎng)。其轉(zhuǎn)化的基本原理為在農(nóng)桿菌侵染植物時(shí)，TDNA 可以插入到植物基因組中，使其攜帶的基因在植物中表達(dá) [88]。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是一種革蘭氏陰性的土壤桿菌，于 1907 年被發(fā)現(xiàn)是植物致病的起因。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的農(nóng)桿菌有兩類，即根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes ） 。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法13 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的理論基礎(chǔ)在目前不同的植物基因轉(zhuǎn)化方法中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法具有簡(jiǎn)單易行、無需昂貴設(shè)備、費(fèi)用低、轉(zhuǎn)化效率高且拷貝數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛的使用。表 1－1 常用植物基因轉(zhuǎn)化方法及其特點(diǎn)比較Table 1－ 1 The methods in mon use of plant gene transformation and parison of their characteristics轉(zhuǎn)化方法 農(nóng)桿菌法 PEG法 電擊法 微針注射法 基因槍法 花粉管通道法受體材料宿主范圍組培條件嵌合體操作復(fù)雜性設(shè)備要求工作效率單子葉植物完整細(xì)胞有簡(jiǎn)單有簡(jiǎn)單便宜高少原生質(zhì)體有復(fù)雜無簡(jiǎn)單便宜低可行原生質(zhì)體無復(fù)雜無復(fù)雜昂貴低可行原生質(zhì)體無復(fù)雜無復(fù)雜昂貴低可行完整細(xì)胞無簡(jiǎn)單無復(fù)雜昂貴高廣泛卵細(xì)胞有性繁殖植物無無簡(jiǎn)單便宜低廣泛在棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系中，主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)（Agrobacteriummediated gene transfer）、花粉管通道（Pollen tube pathway）和基因槍（Particle bombar dment）3種轉(zhuǎn)化方法 [85]。在目前的植物遺傳轉(zhuǎn)化中，已經(jīng)被報(bào)道的方法多達(dá)十幾種，主要分為兩大類 [84]：直接基因轉(zhuǎn)化法（包括基因槍法、PEG介導(dǎo)法等）和載體轉(zhuǎn)移法（包括根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等） 。美國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉大田種植已超過其棉田總面積的70% ，澳大利亞和中國(guó)超過30%，全球轉(zhuǎn)基因棉花種植面積達(dá)到680萬公頃，占世界棉花種植面積的20% [83]。2022年，我國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種植面積達(dá)4600多萬畝，國(guó)產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究12蟲棉種植面積達(dá)70%左右，其中河北、山東、河南、安徽4省實(shí)現(xiàn)了100%的種植。 遺傳轉(zhuǎn)化研究在棉花育種上的應(yīng)用 棉花遺傳轉(zhuǎn)化概述棉花基因工程研究始自1987年,是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行遺傳改良最為成功的作物之一，僅我國(guó)自主研制的 “CryA+CPTⅠ ” 雙價(jià)抗蟲等基因就已被轉(zhuǎn)育到41個(gè)棉花品種中。與棉花體細(xì)胞胚發(fā)生再生植株相比，利用棉花莖尖、子葉節(jié)、胚軸三種外植體誘導(dǎo)直接芽發(fā)生再生植株克服了基因型限制，并且簡(jiǎn)單、快速，變異率低。由于棉花物種本身具有的十分強(qiáng)烈的頂端優(yōu)勢(shì)，利用胚軸培養(yǎng)時(shí)，必須等未被破壞的頂芽長(zhǎng)出切除后，才有多芽產(chǎn)生，從而延長(zhǎng)了多芽獲得的時(shí)間。這種切法制備的胚軸外植體沒有抑制住胚芽的生長(zhǎng)，致使頂芽快速長(zhǎng)出后再切去才能誘導(dǎo)發(fā)生多芽，延長(zhǎng)了獲得多芽的時(shí)間。 胚軸培養(yǎng)及其應(yīng)用11Morre 等 [74]對(duì) Gossypium hirsutum cv. L. Guazuncho II 材料的種子，使其吸水 8 h 后，剝?nèi)シN皮，并解剖出胚，用刀切去子葉和胚根，剩下的即是胚軸外植體，將其接種在添加 6BA 3mg/L 及 20g/L 葡萄糖作碳源的 MSB 培養(yǎng)基上，20 天后，從每個(gè)胚軸外植體平均可獲得 個(gè)芽，用 500ppm IBA 浸泡芽誘導(dǎo)生根，生根率高達(dá) 95％以上。國(guó)內(nèi)張海等 [72,73]也利用棉花子葉作為外植體，直接誘導(dǎo)芽發(fā)生獲得再生植株，但芽的分化頻率較低。 子葉節(jié)培養(yǎng)及其應(yīng)用Agrawal 等 [70] 用 Gossypium hirsutum L. cv. AnjaliLRK 516 材料的 35 天幼苗子葉節(jié)及斬首子葉節(jié)作為外植體，接種在添加 6BA 、KT 糖提供碳源的 MS 培養(yǎng)基，直接誘導(dǎo)多芽發(fā)生，每個(gè)外植體最多產(chǎn)生 個(gè)芽，若在大容器中培養(yǎng)每個(gè)外植體最多產(chǎn)生 個(gè)芽，不加激素 75％生根，添加 NAA 、%。棉花莖尖培養(yǎng)體系的建立，成功的繁殖和保存了許多棉花珍稀種質(zhì)資源及其種間雜種，并在珍稀材料的抗性鑒定和棉花轉(zhuǎn)基因等方面取得了極其重要的研究成果。Gould 等 [61]是最早利用莖尖對(duì)陸地棉和海島棉品種材料在不添加任何激素的 MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到再生植株的，一個(gè)莖尖獲得一棵植株，簡(jiǎn)單、快速，但是誘導(dǎo)芽生根時(shí)依賴基因型。所用的外植體有兩種：莖尖和腋芽。截止目前，棉花器官發(fā)生再生植株的外植體主要是：莖尖、子葉節(jié)、胚軸三種。 棉花器官發(fā)生植株再生研究進(jìn)展器官發(fā)生就是從外植體或其形成的愈傷組織上誘導(dǎo)出根、莖、葉等器官，并逐步形成完整植株的再生方式。張海等 [58]（1998）研究認(rèn)為，適當(dāng)節(jié)位花蕾外植體、培養(yǎng)前的低溫預(yù)處理以及合理的植物生長(zhǎng)物質(zhì)條件是提高棉花花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的主要條件。在花藥愈傷組織誘導(dǎo)上，種間雜種沒顯示出優(yōu)勢(shì)，但陸地棉品種間雜交則表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。張寶紅等 [57]（1994 ）篩選出提高棉花花藥愈傷組織誘導(dǎo)頻率的植物生長(zhǎng)物質(zhì)種類及其組合，對(duì)棉花花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)形成的愈傷組織進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)其中既有單倍體細(xì)胞，又有二倍體細(xì)胞；石蠟切片觀察表明，其中有部分花粉已啟動(dòng)分裂并形成少量愈傷組織。因而，在棉花原生質(zhì)體培養(yǎng)中，要注意選擇那些易于培