【正文】 寄主病原菌的相互作用。Mellon等 [50]（1988）在培養(yǎng)胚珠時在培養(yǎng)基中接種Aapergillus Favus（一種真菌，致使核蛋白對人畜有害） ，發(fā)現(xiàn)胚珠在培養(yǎng)中有與完整植株一樣的抵抗反應(yīng)。③克服種間雜交不親和。胡紹安等 [51]（1992）以陸地棉做母本，分別與瑟伯氏棉（）和克勞茨基棉（Gossypium klotzschianum Anderss.）雜交，獲得了一定頻率的正常雜種胚，并培養(yǎng)成雜種植株。為克服中間雜交不親和性提供了成功的試驗技術(shù)，同時探討了種間雜交不親和性的生理生化機理。④提高遠(yuǎn)緣雜種成胚率。通過胚珠培養(yǎng)可使某些遠(yuǎn)緣雜種的成胚率呈數(shù)倍增長 [52]（張獻(xiàn)龍等，1988） 。雖然胚珠培養(yǎng)對克服棉花種間雜交不親和性、搶救雜種胚是個有效的辦法，但成胚率低，并不是所有的種間雜種都可培養(yǎng)成苗，更重要的是雜種植株不易開花結(jié)果，需加強管理等，這為生產(chǎn)帶來了困難 [53]。原生質(zhì)體培養(yǎng)具有重要的意義，它的發(fā)展和植株再生的成功為開展細(xì)胞再生基礎(chǔ)理論研究、體細(xì)胞雜交、單細(xì)胞變異體篩選、突變育種和遺傳操作等奠定了基礎(chǔ)。棉花原生質(zhì)培養(yǎng)自上世紀(jì)70年代初就引起人們的高度重視，但在國外除Eishihy [54]（1983）報道了從海島棉子葉原生質(zhì)體培養(yǎng)一年后獲得再生植株外，再無棉花原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得成功的報道。棉花原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵在于獲得大量再生植株，而獲得大量再生植株十分困難。其限制因素有三個：①原生質(zhì)體的分裂頻率偏低（～% ）； ②胚狀體發(fā)生較難； ③胚狀體的正常發(fā)育也較難。如何制備和篩選分裂能力和胚狀體發(fā)生能力強的原生質(zhì)體，如何創(chuàng)造合適的培養(yǎng)條件是解決這些問題的關(guān)鍵。雖然中國上世紀(jì)80年代中后期才開始這方面的研究工作，但陳志賢等（1989）[55]已成功地由陸地棉原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得了再生植株。隨后魏良民（1996） [54]以海島棉無菌苗的下胚軸為外植體，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，挑選愈傷組織建立懸浮培養(yǎng)胚性細(xì)胞，9原生質(zhì)體再生細(xì)胞系經(jīng)幾次分裂后產(chǎn)生再生細(xì)胞團(tuán)。經(jīng)過進(jìn)一步探討，現(xiàn)己完善了該體系，并從坷字20313118系、晉棉12 等多個品種獲得了原生質(zhì)體再生植株。其成功的關(guān)鍵有兩點：①選用胚性愈傷組織作為游離棉花原生質(zhì)體的起始物，這樣就保證了游離得到的原生質(zhì)體的生活力，使其細(xì)胞易于持續(xù)分裂并具有極高的植株再生能力；②選用易于培養(yǎng)的基因型。但是，如果基因型選擇不當(dāng)，則往往難以成功；即使成功，工作難度也極大。因而，在棉花原生質(zhì)體培養(yǎng)中，要注意選擇那些易于培養(yǎng)成苗的基因型，如坷字2031冀合321等 [56]。花藥培養(yǎng)是獲得單倍體的途徑之一，在棉花組織培養(yǎng)的早期就己開始這方面的研究，與其它植物相比，因其難度大，一直難有進(jìn)展，直到 1994 年才獲得成功，但其成功頻率較低，目前僅能獲得少量的單倍體愈傷組織、胚狀體、莖狀體和根狀體。張寶紅等 [57]（1994 ）篩選出提高棉花花藥愈傷組織誘導(dǎo)頻率的植物生長物質(zhì)種類及其組合，對棉花花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)形成的愈傷組織進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)其中既有單倍體細(xì)胞，又有二倍體細(xì)胞；石蠟切片觀察表明，其中有部分花粉已啟動分裂并形成少量愈傷組織。試驗中還發(fā)現(xiàn)，亞洲棉愈傷組織誘導(dǎo)率最高，陸地棉次之，海島棉較差，野生種最差。在花藥愈傷組織誘導(dǎo)上，種間雜種沒顯示出優(yōu)勢，但陸地棉品種間雜交則表現(xiàn)出優(yōu)勢。不同基因型誘產(chǎn)生的花藥愈傷組織的顏色、質(zhì)地、生長量和生活力不同，亞洲棉生長量最大，但活力較差。張海等 [58]（1998）研究認(rèn)為，適當(dāng)節(jié)位花蕾外植體、培養(yǎng)前的低溫預(yù)處理以及合理的植物生長物質(zhì)條件是提高棉花花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的主要條件。董新國等 [59]（ 1999）系統(tǒng)研究了小孢子、藥壁結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)過程中所表現(xiàn)出的解剖學(xué)和細(xì)胞學(xué)特點，試圖探索培養(yǎng)花藥的發(fā)育規(guī)律，尋求合適的培養(yǎng)條件促使小孢子去分化啟動分裂，以成功獲得單倍體愈傷。 棉花器官發(fā)生植株再生研究進(jìn)展器官發(fā)生就是從外植體或其形成的愈傷組織上誘導(dǎo)出根、莖、葉等器官，并逐步形成完整植株的再生方式。根據(jù)起源不同可將器官分化分為兩種發(fā)生方式：①器官由切下的外植體中已經(jīng)存在的器官原基發(fā)育而成；②從外植體脫分化中形成愈傷組織，再在新形成的愈傷組織或經(jīng)繼代培養(yǎng)的愈傷組織上產(chǎn)生一些分生細(xì)胞團(tuán)，隨后由這些新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究10分生的細(xì)胞團(tuán)分化成不同的器官原基 [60]。截止目前，棉花器官發(fā)生再生植株的外植體主要是：莖尖、子葉節(jié)、胚軸三種。 莖尖培養(yǎng)及其應(yīng)用棉花莖尖培養(yǎng)根據(jù)取材部位不同可分為主莖頂端莖尖培養(yǎng)和腋芽培養(yǎng)。所用的外植體有兩種：莖尖和腋芽。根據(jù)幼苗來源可分為普通苗莖尖培養(yǎng)和無菌苗莖尖培養(yǎng)，根據(jù)莖尖所取長度的不同可分為一般莖尖培養(yǎng)（0. 3～3. 0 厘米）和微莖尖培養(yǎng)（0. 5～ 毫米） 。Gould 等 [61]是最早利用莖尖對陸地棉和海島棉品種材料在不添加任何激素的 MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到再生植株的，一個莖尖獲得一棵植株，簡單、快速，但是誘導(dǎo)芽生根時依賴基因型。此后，國內(nèi)外許多學(xué)者分別對棉屬不同種進(jìn)行莖尖離體培養(yǎng)，結(jié)果快速地獲得了小植株或發(fā)育正常的植株 [6269]。棉花莖尖培養(yǎng)體系的建立，成功的繁殖和保存了許多棉花珍稀種質(zhì)資源及其種間雜種，并在珍稀材料的抗性鑒定和棉花轉(zhuǎn)基因等方面取得了極其重要的研究成果。然而，棉花莖尖培養(yǎng)的關(guān)鍵是莖尖成芽后的高頻率穩(wěn)定生根問題。 子葉節(jié)培養(yǎng)及其應(yīng)用Agrawal 等 [70] 用 Gossypium hirsutum L. cv. AnjaliLRK 516 材料的 35 天幼苗子葉節(jié)及斬首子葉節(jié)作為外植體，接種在添加 6BA 、KT 糖提供碳源的 MS 培養(yǎng)基，直接誘導(dǎo)多芽發(fā)生，每個外植體最多產(chǎn)生 個芽，若在大容器中培養(yǎng)每個外植體最多產(chǎn)生 個芽，不加激素 75％生根，添加 NAA 、%。Gupta 等 [71]用 G hirsutum L. cv. PKV08RS810 、Pusa 3Pusa2Stoneville、 F108CA1193 、Shyamly、Lohit等材料帶有莖尖的子葉節(jié)作為外植體，接種在添加 6BA ，可以誘導(dǎo)多芽產(chǎn)生，并可以繼代增殖，芽在 NAA 。國內(nèi)張海等 [72,73]也利用棉花子葉作為外植體，直接誘導(dǎo)芽發(fā)生獲得再生植株，但芽的分化頻率較低。由于高濃度 6BA 易使實驗材料外植體褐化嚴(yán)重，從而降低芽分化頻率，造成多芽發(fā)生現(xiàn)象十分不穩(wěn)定。 胚軸培養(yǎng)及其應(yīng)用11Morre 等 [74]對 Gossypium hirsutum cv. L. Guazuncho II 材料的種子，使其吸水 8 h 后，剝?nèi)シN皮，并解剖出胚，用刀切去子葉和胚根，剩下的即是胚軸外植體，將其接種在添加 6BA 3mg/L 及 20g/L 葡萄糖作碳源的 MSB 培養(yǎng)基上，20 天后，從每個胚軸外植體平均可獲得 個芽，用 500ppm IBA 浸泡芽誘導(dǎo)生根，生根率高達(dá) 95％以上。Banerjee 等 [75]將種子在滅菌水 中浸泡 1h，置滅菌潮濕濾紙上于黑暗處發(fā)芽 48h，剝?nèi)シN皮，并解剖出胚，用刀切去子葉和胚根，剩下的長約 2 毫米胚軸用作外植體，在添加 mg/L、NAA mg/L 和提供蔗糖 20g/L 作碳源的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)直接多芽發(fā)生，培養(yǎng) 3 周后，對僅有頂芽生長的外植體，切除伸出的頂芽和長長的下胚軸尾巴，轉(zhuǎn)接于新鮮的多芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，3 周后轉(zhuǎn)接到含有較多培養(yǎng)基的大容器中進(jìn)行 6周培養(yǎng)，此時一個外植體上再生芽數(shù)最高可達(dá) 個，再生芽在 1/2MS + NAA ，生根率最高為 85%。這種切法制備的胚軸外植體沒有抑制住胚芽的生長，致使頂芽快速長出后再切去才能誘導(dǎo)發(fā)生多芽，延長了獲得多芽的時間。Hazar 等 [76] 將消毒種子在滅菌水中浸泡 4h，置滅菌潮濕濾紙上于黑暗處發(fā)芽 24h，用力擠壓將胚軸分離出來，并從正中縱向?qū)⑵渑蓛砂?，每對接種于 MS 培養(yǎng)基上，添加活性炭和在高溫下培養(yǎng)對劈開的胚軸再生植株（只產(chǎn)生一個芽）有協(xié)同效應(yīng)。由于棉花物種本身具有的十分強烈的頂端優(yōu)勢，利用胚軸培養(yǎng)時，必須等未被破壞的頂芽長出切除后，才有多芽產(chǎn)生，從而延長了多芽獲得的時間。棉花生物技術(shù)的重要進(jìn)展是能夠?qū)ιa(chǎn)上應(yīng)用的品種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和離體培養(yǎng)直接再生植株。與棉花體細(xì)胞胚發(fā)生再生植株相比，利用棉花莖尖、子葉節(jié)、胚軸三種外植體誘導(dǎo)直接芽發(fā)生再生植株克服了基因型限制，并且簡單、快速，變異率低。其關(guān)鍵是解決再生芽高頻率生根的問題，以及采取合適的措施盡早抑制頂芽的生長，致使多芽盡早發(fā)生，降低激素濃度防止或減緩?fù)庵搀w的褐化 [77,78]。 遺傳轉(zhuǎn)化研究在棉花育種上的應(yīng)用 棉花遺傳轉(zhuǎn)化概述棉花基因工程研究始自1987年,是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行遺傳改良最為成功的作物之一，僅我國自主研制的 “CryA+CPTⅠ ” 雙價抗蟲等基因就已被轉(zhuǎn)育到41個棉花品種中。1998年，我國種植轉(zhuǎn)基因的抗蟲棉花共有380萬畝，其中95%為外國的抗蟲棉，國產(chǎn)抗蟲棉僅占5% 左右。2022年，我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種植面積達(dá)4600多萬畝，國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究12蟲棉種植面積達(dá)70%左右，其中河北、山東、河南、安徽4省實現(xiàn)了100%的種植。我 國是 世 界 上 第 二 個 有 轉(zhuǎn) 基 因 抗 蟲 棉 花 自 主 知 識 產(chǎn) 權(quán) 的 國 家 ， 國 內(nèi) 已 有 12 個 抗 蟲 棉 品 種通 過 審 定 ，國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種植面積累計達(dá)到7000多萬畝，平均每畝增收140元至160元，為棉農(nóng)增加收益100多億元 [7982]。美國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉大田種植已超過其棉田總面積的70% ，澳大利亞和中國超過30%，全球轉(zhuǎn)基因棉花種植面積達(dá)到680萬公頃，占世界棉花種植面積的20% [83]。 棉花遺傳轉(zhuǎn)化方法外源DNA通過載體介導(dǎo)實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)稱之為基因載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。在目前的植物遺傳轉(zhuǎn)化中，已經(jīng)被報道的方法多達(dá)十幾種，主要分為兩大類 [84]：直接基因轉(zhuǎn)化法（包括基因槍法、PEG介導(dǎo)法等）和載體轉(zhuǎn)移法（包括根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等） 。常用植物基因轉(zhuǎn)化方法及其特點比較見表1－1。表 1－1 常用植物基因轉(zhuǎn)化方法及其特點比較Table 1－ 1 The methods in mon use of plant gene transformation and parison of their characteristics轉(zhuǎn)化方法 農(nóng)桿菌法 PEG法 電擊法 微針注射法 基因槍法 花粉管通道法受體材料宿主范圍組培條件嵌合體操作復(fù)雜性設(shè)備要求工作效率單子葉植物完整細(xì)胞有簡單有簡單便宜高少原生質(zhì)體有復(fù)雜無簡單便宜低可行原生質(zhì)體無復(fù)雜無復(fù)雜昂貴低可行原生質(zhì)體無復(fù)雜無復(fù)雜昂貴低可行完整細(xì)胞無簡單無復(fù)雜昂貴高廣泛卵細(xì)胞有性繁殖植物無無簡單便宜低廣泛在棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系中，主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)（Agrobacteriummediated gene transfer）、花粉管通道（Pollen tube pathway）和基因槍（Particle bombar dment）3種轉(zhuǎn)化方法 [85]。 下面對棉花遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用比較多的幾種方法分別加以介紹。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法13 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的理論基礎(chǔ)在目前不同的植物基因轉(zhuǎn)化方法中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法具有簡單易行、無需昂貴設(shè)備、費用低、轉(zhuǎn)化效率高且拷貝數(shù)少等優(yōu)點而被廣泛的使用。Tzfira [86]等將農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化過程分為七步：① 農(nóng)桿菌與寄主細(xì)胞的識別與附著； ②農(nóng)桿菌對植物信號的感受；③毒性基因的激活；④ 可移動 TDNA 復(fù)合體形成；⑤ TDNA 從細(xì)菌細(xì)胞輸出；⑥ TDNA 導(dǎo)入植物細(xì)胞核；⑦TDNA 整合到植物寄主基因組。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的農(nóng)桿菌有兩類，即根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes ） 。前者含 Ti 質(zhì)粒，后者含 Ri 質(zhì)粒，其中對 Ti質(zhì)粒的研究比較詳細(xì)，而且應(yīng)用最廣泛。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是一種革蘭氏陰性的土壤桿菌，于 1907 年被發(fā)現(xiàn)是植物致病的起因。到 1974 年，人們發(fā)現(xiàn)在農(nóng)桿菌中有一種環(huán)形的 Ti 質(zhì)粒（7200kb） ，Ti 質(zhì)粒上的一段 TDNA，它可以插入植物基因組，引起細(xì)胞特性的變化，形成冠癭瘤。其轉(zhuǎn)化的基本原理為在農(nóng)桿菌侵染植物時，TDNA 可以插入到植物基因組中，使其攜帶的基因在植物中表達(dá) [88]。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的技術(shù)特點和影響轉(zhuǎn)化效率的因素利用農(nóng)桿菌向棉花引人外源基因，其技術(shù)特點有：①棉花是雙子葉植物，易受農(nóng)桿菌感染；②農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是利用天然的轉(zhuǎn)移載體系統(tǒng)，能夠轉(zhuǎn)移界定的 DNA 序列，轉(zhuǎn)化率較高；③外植體的適用范圍廣，可以以原生質(zhì)體、單細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)、組織和器官等為受體進(jìn)行操作，只要建立了成熟的再生技術(shù)體系，就可以實現(xiàn)種質(zhì)轉(zhuǎn)化；④技術(shù)簡單，對設(shè)備沒有特殊要求；⑤轉(zhuǎn)化的外源基因以單拷貝或雙拷貝為主，遺傳穩(wěn)定性好，并且多數(shù)符合孟德爾遺傳規(guī)律 [89,90]。但是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)受到農(nóng)桿菌宿主專一性的限制，農(nóng)桿菌對某些品種的感染效率很低，而且與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的外植體須經(jīng)過愈傷組織、胚胎發(fā)生，最后形成再生植株，獲得轉(zhuǎn)基因植株所需時間較長。在此過程中，體細(xì)胞無性系變異的頻率高，再生苗畸形率高，影響了農(nóng)桿菌法的轉(zhuǎn)化率，同時獲得抗性愈傷后需進(jìn)行