【正文】 GFP 報(bào)告基因的檢測(cè)綠色熒光蛋白（greenfluorescent protein，GFP）是一些腔腸動(dòng)物所特有的生物熒光素蛋白。目前，雖然已取得了后代轉(zhuǎn)化的分子證據(jù)，但仍有許多問(wèn)題需要進(jìn)一步的探討，例如外源 DNA 的整19合機(jī)理、轉(zhuǎn)化后代的基因沉默、拷貝數(shù)量對(duì)表達(dá)水平的影響以及外源基因的表達(dá)檢測(cè)等。龔蓁蓁等 [133]利用 3H 標(biāo)記的棉花總 DNA 于授粉 24h 后導(dǎo)入棉花子房，分時(shí)段取樣，冷凍切片，經(jīng)放射自顯影，看到授粉后珠心與珠孔已相通，珠心孔道是相當(dāng)寬的，易于 DNA 溶液進(jìn)入，80%檢視的胚囊中有 DNA 浸潤(rùn)。遺傳較為復(fù)雜，有些變異既不是供體性狀也不是受體原有性狀，后代的分離現(xiàn)象，有的符合孟德?tīng)栆?guī)律，但大多數(shù)是不符和的 [130132]?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD(zhuǎn)化的棉花植株后代遺傳特點(diǎn)：性狀變異廣泛，類型豐富，穩(wěn)定快，變異頻率較高。幼鈴采用保鈴劑（如NAA、 GA3等）進(jìn)行保鈴，提高轉(zhuǎn)化效率還應(yīng)考慮溫度、濕度、陽(yáng)光等環(huán)境條件及操作技巧 [129]。 花粉管通道轉(zhuǎn)化法的技術(shù)特點(diǎn)和影響效率的因素利用花粉管通道法導(dǎo)入外源 DNA，一般有微注射法、柱頭滴加法、花粉粒攜帶法、花粉勻漿法等。但從進(jìn)化的角度來(lái)看，任何生物 DNA 均由4種核苷酸組成，這樣就可能在順序上出現(xiàn)不同程度的相同排列，因此部分基因的結(jié)構(gòu)有可能保持一定的親合性。 花粉管通道法 花粉管通道轉(zhuǎn)化法的理論基礎(chǔ)1720世紀(jì)70年代末，我國(guó)學(xué)者在遠(yuǎn)緣雜交研究中發(fā)現(xiàn)，授粉時(shí)混入異種作物花粉勻漿，其雜種后代出現(xiàn)了與異種作物相應(yīng)的性狀變異，推測(cè)外源 DNA 可能參與了受精過(guò)程。謝迎秋 [119]對(duì)葉肉細(xì)胞進(jìn)行轟擊研究棉花曲葉病毒反式作用因子Ac2的功能等。培養(yǎng)程序是指微粒轟擊受體后，轉(zhuǎn)化細(xì)胞或多或少受到一定傷害，需要有一個(gè)恢復(fù)調(diào)整過(guò)程，恢復(fù)時(shí)間的確定至關(guān)重要，過(guò)早或過(guò)遲移入都會(huì)導(dǎo)致再生轉(zhuǎn)化率下降。不同的植物材料、不同的轉(zhuǎn)化要求，應(yīng)選擇不同的速度?？梢哉{(diào)控微彈的速度和射入濃度，有固定操作程序，規(guī)范操作，不確定人為因素較少。可以采用農(nóng)藝性狀優(yōu)良的主栽品種及任何需要改良的棉花類型。根據(jù)基因槍的動(dòng)力系統(tǒng)，可將它們分為3種類型：一類是以火藥爆炸力為加速動(dòng)力，也是最早出現(xiàn)的一種基因槍。 基因槍轉(zhuǎn)化法 基因槍轉(zhuǎn)化法的理論基礎(chǔ)基因槍法（Particle gun），又稱微彈轟擊法（Microprojectile bombardment；Particle bomb ardment；Biolistics），是依賴高速度的金屬微粒將外源基因引入活細(xì)胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。此外，還有采用嫁接或過(guò)渡培養(yǎng)等措施提高轉(zhuǎn)基因植株移栽成活率，發(fā)展轉(zhuǎn)基因棉花快速測(cè)定法，改進(jìn)轉(zhuǎn)化條件，提高轉(zhuǎn)化效率等等。目前研究用于感染的外植體有下胚軸、愈傷組織、子葉、胚根等，獲得轉(zhuǎn)化植株的報(bào)道多數(shù)為下胚軸和愈傷組織。一般說(shuō)來(lái),農(nóng)桿菌Vir 基因誘導(dǎo)必須注意以下幾點(diǎn)：①誘導(dǎo)培養(yǎng)基PH值介于5～6之間。乙酰丁香酮的使用還可以減小植物基因型的差異，而在另一些植株的轉(zhuǎn)化上，如草莓等，乙酰丁香酮的使用無(wú)效甚至有害。其次，植物受傷細(xì)胞分泌的某些酚類化合物對(duì)農(nóng)桿菌Vir基因的表達(dá)有誘導(dǎo)作用。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的技術(shù)特點(diǎn)和影響轉(zhuǎn)化效率的因素利用農(nóng)桿菌向棉花引人外源基因，其技術(shù)特點(diǎn)有：①棉花是雙子葉植物，易受農(nóng)桿菌感染；②農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是利用天然的轉(zhuǎn)移載體系統(tǒng)，能夠轉(zhuǎn)移界定的 DNA 序列，轉(zhuǎn)化率較高；③外植體的適用范圍廣，可以以原生質(zhì)體、單細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)、組織和器官等為受體進(jìn)行操作，只要建立了成熟的再生技術(shù)體系，就可以實(shí)現(xiàn)種質(zhì)轉(zhuǎn)化；④技術(shù)簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備沒(méi)有特殊要求；⑤轉(zhuǎn)化的外源基因以單拷貝或雙拷貝為主，遺傳穩(wěn)定性好，并且多數(shù)符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律 [89,90]。前者含 Ti 質(zhì)粒，后者含 Ri 質(zhì)粒，其中對(duì) Ti質(zhì)粒的研究比較詳細(xì)，而且應(yīng)用最廣泛。 下面對(duì)棉花遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用比較多的幾種方法分別加以介紹。 棉花遺傳轉(zhuǎn)化方法外源DNA通過(guò)載體介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)稱之為基因載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。1998年，我國(guó)種植轉(zhuǎn)基因的抗蟲(chóng)棉花共有380萬(wàn)畝，其中95%為外國(guó)的抗蟲(chóng)棉，國(guó)產(chǎn)抗蟲(chóng)棉僅占5% 左右。棉花生物技術(shù)的重要進(jìn)展是能夠?qū)ιa(chǎn)上應(yīng)用的品種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和離體培養(yǎng)直接再生植株。Banerjee 等 [75]將種子在滅菌水 中浸泡 1h，置滅菌潮濕濾紙上于黑暗處發(fā)芽 48h，剝?nèi)シN皮，并解剖出胚，用刀切去子葉和胚根，剩下的長(zhǎng)約 2 毫米胚軸用作外植體，在添加 mg/L、NAA mg/L 和提供蔗糖 20g/L 作碳源的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)直接多芽發(fā)生，培養(yǎng) 3 周后，對(duì)僅有頂芽生長(zhǎng)的外植體，切除伸出的頂芽和長(zhǎng)長(zhǎng)的下胚軸尾巴，轉(zhuǎn)接于新鮮的多芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，3 周后轉(zhuǎn)接到含有較多培養(yǎng)基的大容器中進(jìn)行 6周培養(yǎng)，此時(shí)一個(gè)外植體上再生芽數(shù)最高可達(dá) 個(gè)，再生芽在 1/2MS + NAA ，生根率最高為 85%。Gupta 等 [71]用 G hirsutum L. cv. PKV08RS810 、Pusa 3Pusa2Stoneville、 F108CA1193 、Shyamly、Lohit等材料帶有莖尖的子葉節(jié)作為外植體，接種在添加 6BA ，可以誘導(dǎo)多芽產(chǎn)生，并可以繼代增殖，芽在 NAA 。此后，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者分別對(duì)棉屬不同種進(jìn)行莖尖離體培養(yǎng)，結(jié)果快速地獲得了小植株或發(fā)育正常的植株 [6269]。 莖尖培養(yǎng)及其應(yīng)用棉花莖尖培養(yǎng)根據(jù)取材部位不同可分為主莖頂端莖尖培養(yǎng)和腋芽培養(yǎng)。董新國(guó)等 [59]（ 1999）系統(tǒng)研究了小孢子、藥壁結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)過(guò)程中所表現(xiàn)出的解剖學(xué)和細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)，試圖探索培養(yǎng)花藥的發(fā)育規(guī)律，尋求合適的培養(yǎng)條件促使小孢子去分化啟動(dòng)分裂，以成功獲得單倍體愈傷。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，亞洲棉愈傷組織誘導(dǎo)率最高，陸地棉次之，海島棉較差，野生種最差。但是，如果基因型選擇不當(dāng)，則往往難以成功；即使成功，工作難度也極大。雖然中國(guó)上世紀(jì)80年代中后期才開(kāi)始這方面的研究工作，但陳志賢等（1989）[55]已成功地由陸地棉原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得了再生植株。棉花原生質(zhì)培養(yǎng)自上世紀(jì)70年代初就引起人們的高度重視，但在國(guó)外除Eishihy [54]（1983）報(bào)道了從海島棉子葉原生質(zhì)體培養(yǎng)一年后獲得再生植株外，再無(wú)棉花原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得成功的報(bào)道。④提高遠(yuǎn)緣雜種成胚率。Mellon等 [50]（1988）在培養(yǎng)胚珠時(shí)在培養(yǎng)基中接種Aapergillus Favus（一種真菌，致使核蛋白對(duì)人畜有害） ，發(fā)現(xiàn)胚珠在培養(yǎng)中有與完整植株一樣的抵抗反應(yīng)。胚珠培養(yǎng)在棉花育種中的應(yīng)用已經(jīng)歷了半個(gè)多世紀(jì)的歷史，其研究成果主要有如下幾個(gè)方面：①研新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究8究纖維發(fā)育及其生理特征。國(guó)內(nèi)外當(dāng)前生產(chǎn)上栽培的棉花品種體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力一般均很弱或沒(méi)有，這極大限制了棉花體細(xì)胞培養(yǎng)在品種改良中的應(yīng)用。現(xiàn)已從幾個(gè)棉種十幾個(gè)品種的胚軸、子葉、葉片、葉柄、幼胚等器官誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，并再生出植株，建立了棉花體細(xì)胞胚發(fā)生植株再生的研究實(shí)驗(yàn)體系 [4247]。研究發(fā)現(xiàn)：IAA、2,4D 與 KT 并用時(shí)，IAA最易誘導(dǎo)胚胎發(fā)生，2,4D 最差。Shoemaker [34]（1986）報(bào)道從陸地棉品種珂字 201 和 315 得到再生植株。目前，一些重要有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因植物已陸續(xù)進(jìn)入大田，并取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和環(huán)境效益，在解決人類所面臨的資源短缺、環(huán)境惡化和效益衰退三大難題中顯示出越來(lái)越重要的作用，為農(nóng)業(yè)的持續(xù)、穩(wěn)定發(fā)展提供了強(qiáng)有力的保障 [30]。轉(zhuǎn)基因植物就是人們利用生物技術(shù)為了解決人類的糧食短缺、生態(tài)環(huán)境破壞等問(wèn)題對(duì)現(xiàn)有生物體進(jìn)行改造而產(chǎn)生的。②植物品質(zhì)改良基因工程。 轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用和發(fā)展趨勢(shì)目前植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要在以下方面得到應(yīng)用：①抗性基因工程，也被稱為第一代植物基因工程。具體操作步驟為：通過(guò)提取并在生物體外對(duì) DNA 分子進(jìn)行剪切、拼接、修飾等獲得需要的 DNA 特定片段（目的基因） ；選擇基因的合適運(yùn)載體，使目的基因和運(yùn)載體結(jié)合得到重組 DNA；將重組 DNA 引入植物細(xì)胞并使其增殖；創(chuàng)造條件，使整合目的基因的植物細(xì)胞生長(zhǎng)為植物體，進(jìn)而育成植物優(yōu)良新種（或新品種） [23]。5 植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展趨勢(shì)隨著對(duì)植物組織培養(yǎng)技術(shù)的深入研究和廣泛應(yīng)用，現(xiàn)在又發(fā)展了更多的、更實(shí)用的技術(shù)，這類應(yīng)用技術(shù)主要包括植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)、植物體外受精技術(shù)、植物快速繁殖技術(shù)等。溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致分化芽出現(xiàn)玻璃化苗及褐化程度嚴(yán)重；低則苗生長(zhǎng)緩慢。細(xì)胞分裂素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂、改變頂端優(yōu)勢(shì)和促進(jìn)芽的分化等，常用的有KT、6BA、ZT和2ip等。 ，適當(dāng)?shù)慕档蚿H 值可以降低多酚氧化酶的活性和底物利用率，從而抑制褐變。但在實(shí)際應(yīng)用中組織的再生受植株基因型、組織來(lái)源、生理狀態(tài)等多種因素的影響。由此植物組織培養(yǎng)再生植株的過(guò)程可概括為： ① 體細(xì)胞胚發(fā)生植株再生途徑：通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生再生完整植株。所謂脫分化就是指使已分化的組織（細(xì)胞分裂已停止）在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下恢復(fù)細(xì)胞分裂活性，從已分化的狀態(tài)轉(zhuǎn)變成未分生狀態(tài)。這些研究結(jié)果都是細(xì)胞全能性經(jīng)典例證 [13,14]。經(jīng)過(guò)科學(xué)家的數(shù)十年不斷努力，現(xiàn)在已經(jīng)完全證實(shí)了植物細(xì)胞的全能性。植物細(xì)胞的全能性（totipotancy ）是指植物的每個(gè)細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息和離體細(xì)胞在一定培養(yǎng)條件下具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（細(xì)胞工程） 、重組 DNA 技術(shù)（基因工程）構(gòu)成了植物生物技術(shù)的主體。 植物組織培養(yǎng)理論基礎(chǔ)、應(yīng)用及發(fā)展概況 植物組織培養(yǎng)的概述植物組織培養(yǎng)（Plant tissue culture）是以細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、植物生理學(xué)等學(xué)科為基礎(chǔ)，在人為控制的條件下，把植物的器官、組織、胚胎、細(xì)胞或原生質(zhì)體置于無(wú)菌的環(huán)境中，供給它們足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)給予適宜的環(huán)境，使它們得以生存和發(fā)展的一種培養(yǎng)方法。然而，因?yàn)殚L(zhǎng)期以來(lái)在品種之間雜交使其遺傳變異越來(lái)越狹窄，而且周期較長(zhǎng)，常規(guī)遺傳育種方法在改進(jìn)棉花品質(zhì)、產(chǎn)量和抗性方面已不再像過(guò)去那樣有效。棉花喜溫好光，溫度和光照對(duì)纖維成熟度和強(qiáng)度影響很大。世界上約有 60 多個(gè)國(guó)家種植棉花。 epicotyl and decapitated epicotyl explant。 4 全面考察了影響外植體遺傳轉(zhuǎn)化頻率的多種因素，包括預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、浸染時(shí)間、共培養(yǎng)條件、恢復(fù)培養(yǎng)條件以及乙酰丁香酮（AS）濃度等。經(jīng)過(guò)篩選，選取6BA + NAA 誘導(dǎo)激素組合。利用遺傳工程技術(shù)對(duì)棉花品種進(jìn)行改良的研究越來(lái)越受到廣大科學(xué)研究者的關(guān)注。作者簽名： 日期： 年 月 日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。作者簽名：　　 　 　　 日　 期：　　 　 　　 學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成果。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）原創(chuàng)性聲明和使用授權(quán)說(shuō)明原創(chuàng)性聲明本人鄭重承諾：所呈交的畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文），是我個(gè)人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育單位的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。盡我所知，除文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或組織已經(jīng)發(fā)表或公布過(guò)的研究成果，也不包含我為獲得 及其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或?qū)W歷而使用過(guò)的材料。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果作品。本人授權(quán)　　 　 　大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。然而目前棉花生物技術(shù)的發(fā)展仍然存在著很多障礙，如棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基因型依賴性、棉花組織培養(yǎng)的低效性（耗時(shí)、耗工） 、基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的復(fù)雜性（難重復(fù)，轉(zhuǎn)化率低）和轉(zhuǎn)基因棉花農(nóng)藝性狀的變異等等，這些問(wèn)題已經(jīng)成為棉花生物技術(shù)、棉花功能基因的驗(yàn)證和棉花相關(guān)基因克隆等研究領(lǐng)域的障礙和瓶頸。2 對(duì)供試的四個(gè)材料的上胚軸進(jìn)行處理，采用KT和NAA的激素組合，進(jìn)行多芽誘導(dǎo)，以KT + NAA ， 但誘導(dǎo)出的多芽長(zhǎng)勢(shì)不均，且多芽誘導(dǎo)率低于6BA和NAA的激素組合。結(jié)果表明：預(yù)培養(yǎng)3~5天的上胚軸在添加100mg/L乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌重懸液中浸染15 min后共培養(yǎng)2天，經(jīng)過(guò) 3天的恢復(fù)培養(yǎng)之后用包含50 mg/L卡那霉素和800 mg/L頭孢霉素的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選是較為理想的遺傳轉(zhuǎn)化條件。 direct anogenesis。我國(guó)是世界上最大的棉花生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及整個(gè)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中棉花具有重要的作用。新疆作為我國(guó)特大型的優(yōu)質(zhì)商品棉基地，由于自然條件得天獨(dú)厚，越來(lái)越顯示出其重要性。為了加快育種速度，利用高新技術(shù)，將抗蚜蟲(chóng)基因、抗黃萎基因、抗旱基因、抗鹽堿基因構(gòu)建轉(zhuǎn)化到棉花品種中的研究越來(lái)越受到科學(xué)研究者的關(guān)注。由于培養(yǎng)的對(duì)象大多是脫離植物母體的外植體，培養(yǎng)的器皿一新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究2般是在試管內(nèi)，所以植物組織培養(yǎng)也叫離體（體外