【正文】 大量的擴繁繼代，轉(zhuǎn)化后代階段工作量大。目前，一般首先將目的基因?qū)艘自偕蛐?，再將之與優(yōu)良栽培品種雜交、回交，選擇適宜的材料育成品種。其次，植物受傷細(xì)胞分泌的某些酚類化合物對農(nóng)桿菌Vir基因的表達(dá)有誘導(dǎo)作用。新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究14目前廣泛使用乙酰丁香酮、羥基乙酰丁香酮及植物細(xì)胞培養(yǎng)液來誘導(dǎo)農(nóng)桿菌，并在一些轉(zhuǎn)化中取得好的轉(zhuǎn)化效果 [91,92]。已有實驗表明，一些自身不能產(chǎn)生對Vir基因具有高效誘導(dǎo)的酚類化合物的植物，使用乙酰丁香酮能產(chǎn)生較好的效果。同樣，在共培養(yǎng)時間短、難以誘導(dǎo)Vir基因表達(dá)的情況下,酚類物質(zhì)的使用可能會產(chǎn)生良好的效果 [93,94]。乙酰丁香酮的使用還可以減小植物基因型的差異，而在另一些植株的轉(zhuǎn)化上，如草莓等，乙酰丁香酮的使用無效甚至有害。其他物質(zhì)對Vir基因有誘導(dǎo)作用,如肌醇、非代謝糖類（2脫氧葡萄糖、6 脫氧葡萄糖等） 。采用滲透保護(hù)劑甜菜堿和脯氨酸也可以誘導(dǎo)Vir基因的表達(dá)。此外,不同菌種Vir基因的誘導(dǎo)效果還與誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH有關(guān)。一般說來,農(nóng)桿菌Vir 基因誘導(dǎo)必須注意以下幾點：①誘導(dǎo)培養(yǎng)基PH值介于5～6之間。②農(nóng)桿菌培養(yǎng)溫度，當(dāng)溫度過高超過30℃，將發(fā)生質(zhì)粒丟失；溫度超過28℃，質(zhì)粒致毒區(qū)vir基因不活化，不發(fā)生轉(zhuǎn)化。③培養(yǎng)基中需含有較高的滲透壓 [95]。再有，農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率與棉花品種的基因型、外植體類型、共培養(yǎng)時間、再生體系的建立等一系列因素有關(guān)。目前研究用于感染的外植體有下胚軸、愈傷組織、子葉、胚根等，獲得轉(zhuǎn)化植株的報道多數(shù)為下胚軸和愈傷組織。侵染外植體的農(nóng)桿菌采用LBA4404菌株較好，在侵染前要經(jīng)過活化、～，侵染時間一般為5～15min，共培養(yǎng)時間24～36h。轉(zhuǎn)化后受體材料最好有一定時間的恢復(fù)培養(yǎng)和遵循由低漸高的抗生素梯度篩選，抗生素濃度范圍因抗生素類型及受體材料的不同而變化，卡那霉素濃度范圍一般為 0～100 mg/L [9699]。 目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的研究熱點及應(yīng)用概況目前，利用農(nóng)桿菌進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化的研究主要集中在：基因的高效啟動和表達(dá)[100,101]；農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的改進(jìn)和優(yōu)化，即優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化的體細(xì)胞再生體系，縮短轉(zhuǎn)基因植株的再生周期，通過調(diào)整培養(yǎng)基成分、固化劑濃度及激素水平，改善體胚成熟、分化、生長的條件，減少畸形苗、變異系的發(fā)生 [102]。此外，還有采用嫁接或過渡培養(yǎng)等措施提高轉(zhuǎn)基因植株移栽成活率，發(fā)展轉(zhuǎn)基因棉花快速測定法，改進(jìn)轉(zhuǎn)化條件，提高轉(zhuǎn)化效率等等。1987年Umbeck 等 [103]人將 NPTⅡ 和 CAT 基因?qū)腌孀?12，獲得轉(zhuǎn)基因再生棉株。在國內(nèi)，1994年陳志賢等 [104]將 tfdA 抗除草劑基因?qū)霑x棉7號，通過進(jìn)一步的選擇，培育出晉棉26號（GK951）轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種。國內(nèi)外利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已將 BtCpTAP 等抗蟲基因，tfdA，Bt，aroA等抗除草劑及抗黃萎病、立枯病15等許多有價值的目的基因?qū)朊藁?，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，且獲得的部分轉(zhuǎn)基因棉花已進(jìn)入大田，進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn) [105107]。 基因槍轉(zhuǎn)化法 基因槍轉(zhuǎn)化法的理論基礎(chǔ)基因槍法（Particle gun），又稱微彈轟擊法（Microprojectile bombardment；Particle bomb ardment；Biolistics），是依賴高速度的金屬微粒將外源基因引入活細(xì)胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。其基本原理是將外源 DNA 包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓作用下將微粒高速射入受體組織或細(xì)胞，微粒上的外源 DNA 進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物基因組上，并得到表達(dá)，從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化 [108]。因為微粒的體積非常小，且射擊速度很快，所以外源基因進(jìn)入細(xì)胞后仍能保持正常生物活性，被轟擊過的細(xì)胞或組織，雖含有顆粒，但仍能存活，發(fā)育不受太大的影響。美國Cornell大學(xué)的John Sanford等 [109]于 1987年研制出火藥引爆（ Gunpower）的基因槍。根據(jù)基因槍的動力系統(tǒng)，可將它們分為3種類型：一類是以火藥爆炸力為加速動力，也是最早出現(xiàn)的一種基因槍。其粒子速度主要是通過火藥的數(shù)量及速度調(diào)節(jié)器控制；第2類是以高壓氣體作為動力，如以氦氣、氫氣、氮氣等；第3類是以高壓放電為驅(qū)動力，其最大優(yōu)點是可以無級調(diào)速，通過變化工作電壓，粒子速度和射入濃度可準(zhǔn)確控制。據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，高壓放電和高壓氣體轟擊的轉(zhuǎn)化率均高于火藥引爆法。 基因槍轉(zhuǎn)化法的技術(shù)特點及影響轉(zhuǎn)化率的因素應(yīng)用基因槍技術(shù)轉(zhuǎn)化棉花有以下特點：①無宿主基因型限制，受體類型廣泛。可以采用農(nóng)藝性狀優(yōu)良的主栽品種及任何需要改良的棉花類型。②靶受體類型廣泛?？梢詰?yīng)用棉花幼胚、愈傷組織、下胚軸、莖尖分生組織等等。③可控度高，重復(fù)性好?？梢哉{(diào)控微彈的速度和射入濃度，有固定操作程序，規(guī)范操作，不確定人為因素較少。不足之處為基因槍轉(zhuǎn)化體系外源基因整合位點較多，多拷貝比例相對較高，嵌合體比例較高，易出現(xiàn)共抑制和基因沉默現(xiàn)象，遺傳穩(wěn)定性較差 [110]。關(guān)于影響基因槍法轉(zhuǎn)化率的主要因素分為物理因素和生物因素。物理因素：微彈理化性質(zhì)及其大小、團(tuán)聚性、分散性對轉(zhuǎn)化效果有一定程度的影響；DNA 沉淀劑，常用的 DNA 沉淀劑有Ca 2+ 、亞精胺等，這些化合物的濃度對 新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究16DNA 在微粒上的粘附和植物受體細(xì)胞的傷害均有重要作用；DNA 的純度、濃度及微彈速度，其中微彈速度是影響轉(zhuǎn)化率的一個重要因素，它直接決定了微彈對細(xì)胞和組織的作用力及產(chǎn)生損傷的程度。不同的植物材料、不同的轉(zhuǎn)化要求，應(yīng)選擇不同的速度。生物因素主要是指轉(zhuǎn)化體系和培養(yǎng)程序。轉(zhuǎn)化體系包括外植體的種類、細(xì)胞的生理狀態(tài)、細(xì)胞潛在的再生能力、轟擊前后的培養(yǎng)條件以及內(nèi)環(huán)境對外源 DNA 的接受能力等。應(yīng)選用具有較強分生能力的細(xì)胞、幼嫩的組織、幼胚、莖尖等為外植體，并進(jìn)行預(yù)滲透培養(yǎng)處理等使受體處于感受態(tài)等，以利于提高轉(zhuǎn)化率。培養(yǎng)程序是指微粒轟擊受體后，轉(zhuǎn)化細(xì)胞或多或少受到一定傷害，需要有一個恢復(fù)調(diào)整過程，恢復(fù)時間的確定至關(guān)重要，過早或過遲移入都會導(dǎo)致再生轉(zhuǎn)化率下降。剛剛恢復(fù)過的受傷細(xì)胞通常采用梯度篩選法，即篩選濃度應(yīng)遵循濃度由低漸高的抗性篩選過程，梯度篩選法起始濃度是很重要的，過低會延長轉(zhuǎn)化周期；過高又會嚴(yán)重降低抗性植株轉(zhuǎn)化率 [111]。 基因槍轉(zhuǎn)化法的研究進(jìn)展和應(yīng)用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)在棉花遺傳轉(zhuǎn)化中尚處于研究和起步階段。John [112]等第一次將此技術(shù)應(yīng)用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化中，以胚性懸浮細(xì)胞系為受體進(jìn)行轟擊，成功得到轉(zhuǎn)化植株；之后，McCabe [ 113]、Caryl [114]、吳敬音 [115]、朱衛(wèi)民 [116]等以莖尖分生組織為受體、郝秀英等 [117]以棉花下胚軸為受體，Rajasekaran [118]等用胚性細(xì)胞懸浮系為受體均獲得了抗性轉(zhuǎn)化植株。謝迎秋 [119]對葉肉細(xì)胞進(jìn)行轟擊研究棉花曲葉病毒反式作用因子Ac2的功能等。到目前，使用基因槍進(jìn)行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化不過十幾年的時間，還有許多問題需要進(jìn)一步研究。%～% [120]。因此，如何提高轉(zhuǎn)化率是有待解決的核心問題，國內(nèi)外的研究主要圍繞轉(zhuǎn)化前受體材料類型、滲透處理 [121123]、多莖尖誘導(dǎo)及劈開分生組織暴露出敏感層等，研究和提高外植體的接受能力及外植體的數(shù)量，同時研究轟擊后細(xì)胞的恢復(fù)調(diào)整和梯度篩選強度等，以提高植株再生效率，優(yōu)化轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，進(jìn)而提高基因槍轉(zhuǎn)化率 [124,125]。 花粉管通道法 花粉管通道轉(zhuǎn)化法的理論基礎(chǔ)1720世紀(jì)70年代末，我國學(xué)者在遠(yuǎn)緣雜交研究中發(fā)現(xiàn)，授粉時混入異種作物花粉勻漿，其雜種后代出現(xiàn)了與異種作物相應(yīng)的性狀變異，推測外源 DNA 可能參與了受精過程。周光宇等結(jié)合我國遠(yuǎn)緣雜交的成功經(jīng)驗，提出了遠(yuǎn)緣雜交中存在 DNA 片段雜交的假設(shè) [126,127]，其主要內(nèi)容是，授粉后外源 DNA 能沿著花粉管經(jīng)過的珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞從而參與到新形成的種子中。由于這些細(xì)胞不具備正常的細(xì)胞壁，可作為天然的原生質(zhì)體，易于 DNA 轉(zhuǎn)化，受精后細(xì)胞DNA 復(fù)制活躍，易于外源 DNA 的整合。從整體上說，遠(yuǎn)緣親本間的染色體結(jié)構(gòu)是不親和的。但從進(jìn)化的角度來看，任何生物 DNA 均由4種核苷酸組成，這樣就可能在順序上出現(xiàn)不同程度的相同排列，因此部分基因的結(jié)構(gòu)有可能保持一定的親合性。雖然進(jìn)化中同時存在著相當(dāng)強的保守性，但生物的主要基礎(chǔ)代謝，如糖、氨基酸、能量代謝、蛋白質(zhì)和核酸的生物合成與分解等都是共有的（如有90%以上的已知酶在各種生物中都是共有的）。當(dāng)外源花粉的基因組進(jìn)入母體（受體）后，大部分片段被分解，僥幸保存下來的某些 DNA 片段有可能整合進(jìn)入受體的染色體，在子代中表達(dá)典型的或更多是非典型的遺傳變異。外源 DNA 片段進(jìn)入受體，整合是隨機的，可能整合到結(jié)構(gòu)基因中，也可能通過調(diào)控基因或重復(fù)序列方式發(fā)揮作用 [128]。 花粉管通道轉(zhuǎn)化法的技術(shù)特點和影響效率的因素利用花粉管通道法導(dǎo)入外源 DNA，一般有微注射法、柱頭滴加法、花粉粒攜帶法、花粉勻漿法等。棉花為大花、多胚珠、大子房，一般采用幼子房微注射法。選用成鈴率高部位花，開花前一天扎線，嚴(yán)格自交，開花后 20～48h 對幼鈴的子房注射外源 DNA。注射前，摘去花瓣，抹平花柱，而后用微量加樣器沿子房的縱軸方向垂直進(jìn)針，DNA用量和濃度因總 DNA 或質(zhì)粒 DNA 而不同，總 DNA 用量較多，每次注射1～20uL ，質(zhì)粒 DNA 用量較少，每次注射 ～10uL。幼鈴采用保鈴劑（如NAA、 GA3等）進(jìn)行保鈴，提高轉(zhuǎn)化效率還應(yīng)考慮溫度、濕度、陽光等環(huán)境條件及操作技巧 [129]?；ǚ酃芡ǖ擂D(zhuǎn)化法適宜范圍廣，受體類型廣泛，不受基因型限制。利用花粉管通道可以直接對任何棉花基因型進(jìn)行基因操作，方法簡便，轉(zhuǎn)化速度快，易于常規(guī)育種者掌握，不依賴于組織培養(yǎng)體系，純合速度快；利用活體植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，直接獲得轉(zhuǎn)基因植株，不依賴抗生素篩選，安全性較好。不足之處是外源 DNA 隨機整合新疆棉花高效再生體系建立及其遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究18到棉花染色體基因組，轉(zhuǎn)化植株后代遺傳復(fù)雜；轉(zhuǎn)化的時間受自然花期限制；在田間進(jìn)行操作，受環(huán)境條件的影響很大，因此，操作的經(jīng)驗性很強，需要一定的技術(shù)摸索和技巧。花粉管通道法轉(zhuǎn)化的棉花植株后代遺傳特點：性狀變異廣泛，類型豐富，穩(wěn)定快，變異頻率較高。研究表明，由外源 DNA 直接導(dǎo)入所引起的性狀變異，涉及棉花的各類質(zhì)量和數(shù)量性狀，包括植株形態(tài)、生長發(fā)育、生理生化、抗性、產(chǎn)量構(gòu)成等各個方面，一般變異性狀在第三或第四代就能夠穩(wěn)定，大大縮短了育種進(jìn)程。同時，總 DNA導(dǎo)入引起的變異在表型、生理生化產(chǎn)物及 DNA 分子標(biāo)記的3個層次上與常規(guī)育種產(chǎn)生的變異極為相似。通常轉(zhuǎn)化率為1%～10% 。遺傳較為復(fù)雜，有些變異既不是供體性狀也不是受體原有性狀，后代的分離現(xiàn)象，有的符合孟德爾規(guī)律，但大多數(shù)是不符和的 [130132]。王關(guān)林等 [25]認(rèn)為，裸露的外源DNA 直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化過程中進(jìn)入受體細(xì)胞的外源 DNA 拷貝數(shù)較多，整合到植物細(xì)胞基因組的拷貝數(shù)和整合位點也較多，外源 DNA的結(jié)構(gòu)變化復(fù)雜，在受體細(xì)胞中的遺傳穩(wěn)定性較差，但已經(jīng)整合到植物基因組的外源 DNA一般都能穩(wěn)定遺傳，只是遺傳規(guī)律性較差。在轉(zhuǎn)化后代中還存在外源基因不表達(dá)現(xiàn)象等。 花粉管通道轉(zhuǎn)化法的在棉花上的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用利用花粉管通道法實現(xiàn)棉花遺傳轉(zhuǎn)化是外源 DNA 直接導(dǎo)入植物體成功的例子之一。龔蓁蓁等 [133]利用 3H 標(biāo)記的棉花總 DNA 于授粉 24h 后導(dǎo)入棉花子房，分時段取樣，冷凍切片，經(jīng)放射自顯影，看到授粉后珠心與珠孔已相通，珠心孔道是相當(dāng)寬的，易于 DNA 溶液進(jìn)入，80%檢視的胚囊中有 DNA 浸潤。在進(jìn)入胚囊的途徑中，自顯斑點主要集中顯現(xiàn)在珠心孔道內(nèi)，即花粉管通道，在花粉管通道以外的珠心組織無標(biāo)記顯示，表明授粉后形成的花粉管通道是外源 DNA 進(jìn)入胚囊的天然的唯一途徑。鄧德旺 [134]等報道了采用激光共聚焦顯微技術(shù)等細(xì)胞生物學(xué)方法評價花粉管通道轉(zhuǎn)基因的技術(shù)原理?；ǚ酃芡ǖ擂D(zhuǎn)基因技術(shù)首先由我國科學(xué)家提出并在許多作物遺傳轉(zhuǎn)化中取得了成功，由于這一工作在初期階段是以總 DNA 為外源基因供體，雖能引起后代發(fā)生變異，但對外源 DNA 進(jìn)入胚囊、卵細(xì)胞或受精卵導(dǎo)致核基因組或細(xì)胞質(zhì)基因組的行為及整合機理，以及引起特定而廣泛變異的機制和轉(zhuǎn)化后的表達(dá)與調(diào)節(jié)等問題缺乏理論上的確切認(rèn)識，致使國內(nèi)外一些學(xué)者對其可靠性提出了質(zhì)疑。目前，雖然已取得了后代轉(zhuǎn)化的分子證據(jù)，但仍有許多問題需要進(jìn)一步的探討，例如外源 DNA 的整19合機理、轉(zhuǎn)化后代的基因沉默、拷貝數(shù)量對表達(dá)水平的影響以及外源基因的表達(dá)檢測等。之后，我國學(xué)者通過此方法陸續(xù)將BT、BT+CpTI，SGNA等基因?qū)胫袊髟悦藁ㄆ贩N中，目前已育成許多轉(zhuǎn)基因品種（系）。通過PCR，Southern ，Western Blot 等試驗手段提供了花粉管導(dǎo)入法導(dǎo)入的外源 DNA 整合到棉花基因組，并表達(dá)相應(yīng)性狀的確鑿的分子證據(jù)，結(jié)合田間直接生物學(xué)鑒定，充分證明此方法是一個天然有效的轉(zhuǎn)基因途徑。該技術(shù)的建立開創(chuàng)了整株植物活體基因轉(zhuǎn)化的新途徑，經(jīng)過多年來不斷的研究和改進(jìn)，該技術(shù)日趨成熟，在我國棉花轉(zhuǎn)基因育種研究中發(fā)揮著重要作用 [135138]。 GFP 報告基因的檢測綠色熒光蛋白（greenfluorescent protein，GFP）是一些腔腸動物所特有的生物熒光素蛋白。生物熒光素蛋白是指存在于生物體的，能在激發(fā)光作用下發(fā)射出熒光的蛋白質(zhì)。1971 年 Morin 等在能夠發(fā)出綠光的維多利亞水母（Aequorea