【正文】 要求）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法適合樣品量大、檢測的基因種類相對較少、精度要求 較高的實驗。（（ 2）、探針法適合常被用作基因含量的精確檢測）、探針法適合常被用作基因含量的精確檢測 (精確度可達幾十個拷貝精確度可達幾十個拷貝 ) 及基因表達變化的精確分析（精確度可達及基因表達變化的精確分析（精確度可達 ）。四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化自行配制熒光定量、自行配制熒光定量 PCR試劑試劑（（ 1）、常用的）、常用的 SYBR GreenⅠⅠ 預(yù)混酶預(yù)混酶 （（ 2X）） HotStar TaqE ＋＋ Buffer ＋＋ Mg2 其中其中 Mg2＋濃度為＋濃度為 6～～ 7mM（（ 2）、常用的）、常用的 Taqman預(yù)混酶（預(yù)混酶（ 2X）） TaqE ＋＋ Buffer ＋＋ Mg2 其中其中 Mg2＋濃度為＋濃度為 10mM五、實驗方案的選擇五、實驗方案的選擇定量 PCR實驗方案定量 PCR實驗方案熒光染料法Taqman探針法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2 △△△△ CT法法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2 △△△△ CT法法五、實驗方案的選擇五、實驗方案的選擇定量 PCR實驗方案（（ 1）、染料法適合于基因含量及基因表達變化的粗略分析或初篩；在分析）、染料法適合于基因含量及基因表達變化的粗略分析或初篩；在分析 的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。 其中最關(guān)鍵的因素其中最關(guān)鍵的因素 ：： Mg2＋＋ 濃度濃度 、 熒光基團濃度、引物濃度熒光基團濃度、引物濃度 對于對于 SYBR GreenⅠⅠ 熒光染料定量熒光染料定量 PCR反應(yīng)體系來說，反應(yīng)體系來說， Mg2＋＋ 的最佳濃的最佳濃度度為為 ；； 對于對于 Taqman探針反應(yīng)體系來說，探針反應(yīng)體系來說， Mg2＋＋ 的最佳濃度為的最佳濃度為 ，引左右，引物物最佳濃度為最佳濃度為 500nM，探針的最佳濃度為，探針的最佳濃度為 250nM。普通普通 PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 模板模板 引物引物 Taq酶酶 Buffer Mg2＋＋ 水水定量 PCR反應(yīng)體系 模板模板 引物引物 熒光基團熒光基團 Taq酶酶 Buffer Mg2＋＋ 水水四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系、為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系普通 PCR結(jié)果電泳圖 添加熒光基團后 PCR結(jié)果電泳圖四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化如何優(yōu)化、如何優(yōu)化 由上圖可知，添加熒光基團后，由上圖可知，添加熒光基團后， PCR的反應(yīng)效率幾乎為的反應(yīng)效率幾乎為 0，所以必須對，所以必須對熒光定量熒光定量 PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，對體系中各個反應(yīng)成分的濃度進行調(diào)整。 四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系、為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系 與普通與普通 PCR反應(yīng)相比，熒光定量反應(yīng)相比，熒光定量 PCR在反應(yīng)中加入了熒光物質(zhì)，用以實在反應(yīng)中加入了熒光物質(zhì)，用以實時顯示反應(yīng)的進程，時顯示反應(yīng)的進程， Taqman探針法在普通探針法在普通 PCR反應(yīng)體系中加入了與擴增片反應(yīng)體系中加入了與擴增片段段互補的一段帶熒光標(biāo)記的核酸序列，互補的一段帶熒光標(biāo)記的核酸序列， Taq酶除了酶除了 5’3’聚合酶作用之外，還要聚合酶作用之外，還要發(fā)揮發(fā)揮 5′3′外切酶的活性來水解探針鏈來產(chǎn)生熒光；外切酶的活性來水解探針鏈來產(chǎn)生熒光； SybrGreen法加入了法加入了能與雙鏈核酸結(jié)合的熒光染料，這些熒光物質(zhì)都能影響能與雙鏈核酸結(jié)合的熒光染料，這些熒光物質(zhì)都能影響 Taq酶的活性進而影酶的活性進而影響響 PCR的反應(yīng)效率。 對于比較精確的實驗，最好采用兩種或兩種以上表達穩(wěn)定的基因作為對于比較精確的實驗，最好采用兩種或兩種以上表達穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參，對每種內(nèi)參基因測得的基因表達變化求方差和平均值。 也可用也可用 geNorm內(nèi)參分析軟件來選擇合適的內(nèi)參基因。三、內(nèi)參基因的選擇三、內(nèi)參基因的選擇內(nèi)參基因的選擇策略、內(nèi)參基因的選擇策略 根據(jù)實驗的實際情況，不同組織、不同細胞、細胞的不同生理時期、根據(jù)實驗的實際情況，不同組織、不同細胞、細胞的不同生理時期、不同的理化條件刺激等，查閱相關(guān)資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做不同的理化條件刺激等，查閱相關(guān)資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做熒光定量熒光定量 PCR，先以，先以 CT值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與其其相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說明該基因相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說明該基因表達穩(wěn)定，適合作為理想的內(nèi)參。（（ 3）、）、 18srRNA 當(dāng)細胞有絲分裂時，當(dāng)細胞有絲分裂時， 18srRNA表達量顯著上調(diào)。（（ 2）、）、 βactin 當(dāng)細胞向惡性轉(zhuǎn)化時，當(dāng)細胞向惡性轉(zhuǎn)化時， βactin mRNA的表達水平增加。在各種因素 (例如低氧、胰島素、地塞米松、絲裂原、表皮生長因子等例如低氧、胰島素、地塞米松、絲裂原、表皮生長因子等 )刺激下，培養(yǎng)細胞刺激下，培養(yǎng)細胞 GAPDH mRNA的表達水平也不同。三、內(nèi)參基因的選擇三、內(nèi)參基因的選擇常用內(nèi)參基因的表達情況、常用內(nèi)參基因的表達情況（（ 1）、）、 GAPDH GAPDH mRNA在不同癌組織在不同癌組織 (包括肺癌、乳腺癌、腎細胞癌等包括肺癌、乳腺癌、腎細胞癌等 )中的表達中的表達升高，在不同個體間、懷孕期間以及細胞周期的不同階段等變化很大，在升高，在不同個體間、懷孕期間以及細胞周期的不同階段等變化很大，在正常的結(jié)腸上皮、人類前列腺癌的細胞周期不同階段也呈現(xiàn)出顯著性變正常的結(jié)腸上皮、人類前列腺癌的細胞周期不同階段也呈現(xiàn)出顯著性變化。盲目地使用一種看家基因作為內(nèi)參，一方面可能使基因表達的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另一種看家基因作為內(nèi)參，一方面可能使基因表達的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另一方面可能引致錯誤甚至相反的結(jié)論。 理想的內(nèi)參基因很少或者說不存在，因為所有基因在不同的細胞或組理想的內(nèi)參基因很少或者說不存在，因為所有基因在不同的細胞或組織中、在細胞的不同生理時期、在不同的理化等外界刺激下，其表達量都織中、在細胞的不同生理時期、在不同的理化等外界刺激下，其表達量都會有所差異，會有所差異， 有時可以是幾倍、幾十倍甚至是上百倍的差異。三、內(nèi)參基因的選擇三、內(nèi)參基因的選擇理想的內(nèi)參基因具有的特點、理想的內(nèi)參基因具有的特點（（ 1）、不存在假基因；）、不存在假基因；（（ 2）、高度或中度表達，排除太高或低表達）、高度或中度表達，排除太高或低表達（（ 3）、穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織）、穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織 (如正常細胞和癌細胞如正常細胞和癌細胞 )，而且其，而且其 表達量是近似的，無顯著性差別；表達量是近似的，無顯著性差別；（（ 4）、表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關(guān)；）、表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關(guān)；（（ 5）、其穩(wěn)定的表達水平與目標(biāo)基因相似；）、其穩(wěn)定的表達水平與目標(biāo)基因相似；（（ 6）、不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的）、不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的 影響。 95℃℃ ， 20s， 60℃℃ ， 20s， 40個個 cycles；看熒光本底和；看熒光本底和 熒光強度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著熒光強度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著 PCR反應(yīng)，熒反應(yīng)，熒 光強度不會變化，假如熒光強度變化的比較大，說明探針合成質(zhì)量光強度不會變化，假如熒光強度變化的比較大，說明探針合成質(zhì)量 較差，建議重新合成。分析，引物和探針特異性較好。左右。復(fù)性延伸。 該方法特別適合于樣品量不大，但是檢測的基因種類很多的情況。而且在接下來的實驗中，無需再做標(biāo)準(zhǔn)品。）、該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實驗。定量的基本公式來求出目的基因的差異表達。法。因等。常用的內(nèi)參基因是在各種生理條件下表達量恒定的基因，這些基的差異。趨勢如何就行了，而無需知道該基因的絕對量有多少。曲同工之處。能分析出來。核酸雙鏈的值。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR線性關(guān)系成立的條件分析線性關(guān)系成立的條件分析 LogX0與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品 Ct值，就可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出未知樣品初始模板量。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR線性關(guān)系成立的條件分析線性關(guān)系成立的條件分析左圖橫坐標(biāo)是左圖橫坐標(biāo)是 PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強度循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強度 Rn，改圖反映的是各個樣品隨，改圖反映的是各個樣品隨著每輪著每輪 PCR反應(yīng)，其總的熒光量的實時變化；右圖橫坐標(biāo)也是反應(yīng)，其總的熒光量的實時變化；右圖橫坐標(biāo)也是 PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強度與熒光本底的差值是總的熒光強度與熒光本底的差值 RT –RB即即 △△ Rn的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直線上所有樣品的直線上所有樣品的 RT –RB的對數(shù)都相同，熒光定量的對數(shù)都相同，熒光定量 PCR的線性關(guān)系才會成立。 也就是說，也就是說， 所有樣品的所有樣品的 lgX0與到達閾值時的循環(huán)數(shù)與到達閾值時的循環(huán)數(shù) n（（ Ct值）呈線性值）呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即 Ct值就可計算出樣品中所含的模值就可計算出樣品中所含的模板量板量CT一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR線性關(guān)系成立的條件分析線性關(guān)系成立的條件分析CT lg(1+ E) = lgX0 + lg(RT RB) –lg Rs（（ 1）、）、 PCR效率相等，在效率相等，在 PCR擴增的指數(shù)期，擴增的指數(shù)期， E穩(wěn)定且為常數(shù)；穩(wěn)定且為常數(shù)；（（ 2）、）、 RT –RB 要要 相等；也就是說到達閾值時樣品的熒光強度與樣品的熒相等；也就是說到達閾值時樣品的熒光強度與樣品的熒 光本底之差要相等；光本底之差要相等；（（ 3）、樣品的單位信號強度）、樣品的單位信號強度 Rs要相等，用熒光染料做熒光基團時，要相等，用熒光染