熒光定量pcr-文庫吧資料
2025-08-07 17:11本頁面
【正文】 18 17 實驗組 16 2 △△ Ct法： 假設(shè)目的基因和參照基因擴增效率都接近 100% △ Ct（對照組）＝ Ct 靶基因－ Ct GAPDH = 18－ 17＝ 1 △ Ct（實驗組）＝ Ct 靶基因－ Ct GAPDH = 16－ =－ ΔΔCt = ΔCt實驗組－ ΔCt對照組＝－ － 1＝－ 比率 （實驗組 /對照組） =2－△△ Ct＝ 2－（－ ） = 所以 Jun基因在實驗組表達水平是對照組的 修正方法：如果我們知道目標基因和參照基因有相同的擴增效率，但擴增效率不等于 2，那么2－△△ Ct可以修正為： E－△△ Ct，例如擴增效率為 ，那么計算公式可修正為 －△△ Ct 應用實例 —— MicroRNA 熒光定量 PCR microRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為 22個核苷酸的非編碼單鏈 RNA分子 ,它們在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控 。 RNA抽提、反轉(zhuǎn)效率不同，操作中存在誤差。 擴增效率（ E）： , 越接近 1，越理想。 根據(jù)未知樣品的 Ct值，推算出未知樣本量。 4. 實驗完成后 ， 提供完整的實驗報告 （ 含軟件分析結(jié)果 ）及引物等實驗材料 。 2. 提 DNA/ RNA 。 R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation Q Excitation Taqman 工作示意圖 Taqman法的優(yōu)缺點 優(yōu)點 ? 高度特異性 ? 重復性好 ? 靈敏度高 ? 可進行多重定量 缺點 ? 只適合一個特定的目標 ? 委托公司標記，價格較高 ? 不易找到本底低的探針 R Q Excitation Excitation Emission 分子信標 (Molecular beaco) 分子信標 是一種在靶 DNA 不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標記寡核苷酸探針。 (dI/dT) 峰值代表斜率改變最大時的溫度值，即 Tm，其值與雙鏈 DNA的長度、 GC%含量有關(guān)，可部分代表序列的特異性 融解曲線分析，單一峰 無非特異性熒光 定量準確 融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰 其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準確 Taqman 工作原理 ?探針與靶序列配對 （一段序列，兩個基團， 5’ 報告基團、 3’淬滅基團） ?完整的探針，報告基團 R發(fā)射的熒光被淬滅基團 Q淬滅，沒有熒光產(chǎn)生。 缺點： ? SYBR Green與所有雙鏈 DNA結(jié)合 引物二聚體或錯誤擴增產(chǎn)物造成假陽性 只能檢測單一模板，無法進行多重檢測 ? 靈敏度低 適合于 5000拷貝以上的基因定量 溫度 熒光強度 熔解曲線分析 PCR過程結(jié)束后 ， 將溫度緩慢升高 ， 此時雙鏈 DNA解鏈成為單鏈 ，內(nèi)摻染料會被釋放出來
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