熒光定量pcr-資料下載頁
2025-08-01 17:11本頁面
【正文】 Ct 靶基因－ Ct GAPDH = 16－ =－ ΔΔCt = ΔCt實(shí)驗(yàn)組－ ΔCt對照組＝－ － 1＝－ 比率 （實(shí)驗(yàn)組 /對照組） =2－△△ Ct＝ 2－（－ ） = 所以 Jun基因在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)水平是對照組的 修正方法：如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有相同的擴(kuò)增效率，但擴(kuò)增效率不等于 2，那么2－△△ Ct可以修正為： E－△△ Ct，例如擴(kuò)增效率為 ，那么計(jì)算公式可修正為 －△△ Ct 應(yīng)用實(shí)例 —— MicroRNA 熒光定量 PCR microRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為 22個核苷酸的非編碼單鏈 RNA分子 ,它們在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控 。 到目前為止 ， 已報道有幾千種 miRNA存在于動物 、 植物 、 真菌等多細(xì)胞真核生物中 ， 進(jìn)化上高度保守 。 Micro RNA熒光定量 PCR優(yōu)勢 microRNA實(shí)時定量 PCR檢測技術(shù)最近才有所發(fā)展，相對其它熒光定量檢測技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)： 只對成熟 microRNA 進(jìn)行定量，有效區(qū)分成熟 microRNA分子和前體分子以及其它成熟 microRNA的同源分子； 省時省力 整個操作只需兩步，不到 3個小時，即可獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)； 節(jié)省樣品 樣品消耗少，僅需 110ng 的總 RNA或 50pg左右的 microRNA TaqMan MicroRNA 分析方法 發(fā)夾狀引物的反轉(zhuǎn)錄熒光定量 PCR miRNA Step 1: Stemloop RT Step 2: Realtime PCR F Q Oligos required per miRNA 1. Specific RT primer 2. Specific forward primer 3. Specific reverse primer 4. Specific TaqMan174。 probe Enzymes required 1. Reverse transcriptase 2. AmpliTaq Gold174。 DNA Polymerase SYBR Green MicroRNA 分析方法 MicroRNA 定量方法 ? Estimated synthetic miRNA input (lin4) in RT based on OD: 70771 copies ? 實(shí)驗(yàn)證明可達(dá) 7個數(shù)量級的線性范圍 Slope = R2 = No. PCR cycles Fluorescence signal (?Rn) No. copies Threshold Cycle (CT) 70M copies 7 copies A B Stemloop RTPCR miRNA assays 高度的重現(xiàn)性 let7a miR20 miR3245 miR16
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