實時定量pcrppt課件-資料下載頁
2025-01-17 16:43本頁面
【正文】 熒光定量 PCR的解析方法 相對定量 內(nèi)參基因 目的基因 1 2 內(nèi)參基因 ? 內(nèi)參基因 ： qRTPCR時，每個標本都要做對應的內(nèi)參，而且每次都是管家基因，一般用βactin，有時也用 GAPDH。 ? 管家基因 ：又稱 持家基因 (housekeeping genes)生物體各類細胞中都表達，其產(chǎn)物是對維持細胞基本生命活動所必需的蛋白質(zhì)編碼的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等。是為維持細胞基本生命活動所需而時刻都在表達的基因。 內(nèi)參基因的選擇 ? 理想的內(nèi)參基因應該滿足以下條件 ： ? 不存在假基因，以避免基因 DNA的擴增 ? 高度或中度表達，排除低表達 ? 穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織（如正常細胞和癌細胞），而且其表達量是近似的，無顯著性差別 ? 表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關 ? 其穩(wěn)定的表達水平與目標基因相似 ? 不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的影響 常用內(nèi)參基因 家蠶常用內(nèi)參基因 ? Actin3 ? GAPDH ? sw22934 數(shù)據(jù) 處理（ ΔΔCt法） qRTP C R的優(yōu)點及限制因素 ? qRTPCR不僅實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī) PCR相比，它具有 操作簡便 、 快速高效 、 敏感性 高 、 特異性 強 、有效解決了 PCR污染 的問題、 自動化程度高 等特點 qRTPCR限制因數(shù) ? 實驗費用昂貴，需要設置多組重復和對照 ? 怎樣避免擴增基因組 DNA、如何消除和評定由于樣品處理、儀器的差異和個人操作而帶來的誤差以及如何更準確定量基因？ ? 值得指出的是， qRTPCR只能定量 mRNA水平，但mRNA水平可能不能反映細胞中蛋白水平，因為在轉(zhuǎn)錄后還有諸多調(diào)節(jié)因素。 ? 要準確而全面的了解機體的表達水平，除了分析 mRNA水平外，還需要免疫組織化學和生物化學實驗的數(shù)據(jù)。 ? 更多關于 qRTPCR的信息，請參照 ： 引物設計 ? 常用引物設計軟件： primer Premier， Oligo ? 序列應位于高度保守區(qū)，與非擴增區(qū)無同源序列 ? 引物長度： 1725bp ? 堿基盡可能隨機分布 , GC%： 40%60% ? 盡量避免 錯配（ False Priming)、引物二聚體(Dimer)和 發(fā)夾結構（ Hairpin） 引物設計 ? 引物長度： 1725bp ? GC%: 4060% ? Tm:60℃ （ Primer Premier ） ? 產(chǎn)物長度： 80300bp,100200bp最佳
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