實(shí)時(shí)定量pcrppt課件-資料下載頁
2025-01-17 16:43本頁面
【正文】 熒光定量 PCR的解析方法 相對(duì)定量 內(nèi)參基因 目的基因 1 2 內(nèi)參基因 ? 內(nèi)參基因 ： qRTPCR時(shí)，每個(gè)標(biāo)本都要做對(duì)應(yīng)的內(nèi)參，而且每次都是管家基因，一般用βactin，有時(shí)也用 GAPDH。 ? 管家基因 ：又稱 持家基因 (housekeeping genes)生物體各類細(xì)胞中都表達(dá)，其產(chǎn)物是對(duì)維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的蛋白質(zhì)編碼的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等。是為維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所需而時(shí)刻都在表達(dá)的基因。 內(nèi)參基因的選擇 ? 理想的內(nèi)參基因應(yīng)該滿足以下條件 ： ? 不存在假基因，以避免基因 DNA的擴(kuò)增 ? 高度或中度表達(dá)，排除低表達(dá) ? 穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織（如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞），而且其表達(dá)量是近似的，無顯著性差別 ? 表達(dá)水平與細(xì)胞周期以及細(xì)胞是否活化無關(guān) ? 其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似 ? 不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實(shí)驗(yàn)處理措施的影響 常用內(nèi)參基因 家蠶常用內(nèi)參基因 ? Actin3 ? GAPDH ? sw22934 數(shù)據(jù) 處理（ ΔΔCt法） qRTP C R的優(yōu)點(diǎn)及限制因素 ? qRTPCR不僅實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī) PCR相比，它具有 操作簡(jiǎn)便 、 快速高效 、 敏感性 高 、 特異性 強(qiáng) 、有效解決了 PCR污染 的問題、 自動(dòng)化程度高 等特點(diǎn) qRTPCR限制因數(shù) ? 實(shí)驗(yàn)費(fèi)用昂貴，需要設(shè)置多組重復(fù)和對(duì)照 ? 怎樣避免擴(kuò)增基因組 DNA、如何消除和評(píng)定由于樣品處理、儀器的差異和個(gè)人操作而帶來的誤差以及如何更準(zhǔn)確定量基因？ ? 值得指出的是， qRTPCR只能定量 mRNA水平，但mRNA水平可能不能反映細(xì)胞中蛋白水平，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)錄后還有諸多調(diào)節(jié)因素。 ? 要準(zhǔn)確而全面的了解機(jī)體的表達(dá)水平，除了分析 mRNA水平外，還需要免疫組織化學(xué)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。 ? 更多關(guān)于 qRTPCR的信息，請(qǐng)參照 ： 引物設(shè)計(jì) ? 常用引物設(shè)計(jì)軟件： primer Premier， Oligo ? 序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列 ? 引物長(zhǎng)度： 1725bp ? 堿基盡可能隨機(jī)分布 , GC%： 40%60% ? 盡量避免 錯(cuò)配（ False Priming)、引物二聚體(Dimer)和 發(fā)夾結(jié)構(gòu)（ Hairpin） 引物設(shè)計(jì) ? 引物長(zhǎng)度： 1725bp ? GC%: 4060% ? Tm:60℃ （ Primer Premier ） ? 產(chǎn)物長(zhǎng)度： 80300bp,100200bp最佳
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