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2025-05-12 03:08本頁(yè)面
【正文】 loblastosis virus） ： 酶活性最適溫度 42℃ MMLV（ Moloney murine leukemia virus） ：酶活性最適溫度 37℃ （ 2） 定量 RTPCR（ qRTPCR） ： 利用 RTPCR對(duì) mRNA水平進(jìn)行半定量或絕對(duì)定量分析 。 半定量 RTPCR 選用在組織中普遍表達(dá)、表達(dá)量比較恒定的管家基因 mRNA作為內(nèi)源性基因模板標(biāo)準(zhǔn)。 管家基因 mRNA和目的 mRNA混合物共同進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在各自的引物引導(dǎo)下擴(kuò)增。 計(jì)算出擴(kuò)增后 目的基因擴(kuò)增子 /管家基因擴(kuò)增子的比值，從而達(dá)到半定量的目的。 ? 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 常規(guī)定量 PCR技術(shù)： — 對(duì) PCR擴(kuò)增反應(yīng)的 終產(chǎn)物 進(jìn)行定量 — 重復(fù)性差 — 半定量 實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)： 對(duì) PCR擴(kuò)增反應(yīng)中 每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物 進(jìn)行定量 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR原理 ? 在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。 （ 1） Ct 值 ? 是 熒光定量 PCR的 一 個(gè)重要 的 概念， C代表 Cycle， t代表 threshold。 ? 含義是： 每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào) 到達(dá)設(shè)定 的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) 。 （ 2）熒光域值（ threshold）的設(shè)定 ? PCR反應(yīng)的前 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào) ? 熒光域值是 315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10倍，即： threshold = 10 180。 SDcycle 315 Ct值的確定 （ 3） Ct值與起始模板的關(guān)系 ?理想的 PCR反應(yīng)： ? X=X0*2n ?非理想的 PCR反應(yīng)： ? X=X0 (1+Ex)n ? n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) ? X：第 n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 ? X0：初始模板量 ? Ex：擴(kuò)增效率 在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí) : XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt： 熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。 在閾值線設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，我們?cè)O(shè)為 M。 方程式 (1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得 : log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式 (2)得 : log X0= log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到 域值的循環(huán)數(shù)即 Ct值， 就可計(jì)算出樣品中所含的模板量。 ? 模板 DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct值越小 ? Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品 Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量 ?確定未知樣品的 C(t)值 ?通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的 C(t)值推算出其初始量 Sample 25 （ 4） 熒光標(biāo)記方法 可 分為兩種： — 熒光探針（ Taqman） — 熒光染料（ SYBR Green）
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