【正文】 定量 ? 基因型分析 ? 產(chǎn)物鑒定 ? SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析 Molecular beacon (分子信標(biāo) )特點(diǎn) A、 SNP檢測(cè)。 B、多重 PCR。 C、難設(shè)計(jì)、合成。 D、產(chǎn)生的熒光信號(hào)較低。 E、價(jià)格昂貴 。 F、在退火時(shí)搜集熒光信號(hào)。 方法 4： FRET探針?lè)? FRET探針由兩條相鄰探針組成，在一條探針的 5’ 端標(biāo)記 FAM熒光基團(tuán)， 另一探針的 3’端標(biāo)記 Red 640 （或 Red 705）熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時(shí)，探針結(jié)合在模板 上 FAM 基團(tuán)和 Red 640基團(tuán)相鄰，激發(fā) FAM產(chǎn)生的熒 光，作為 Red 640基團(tuán)的激發(fā)光被吸收，使 Red 640發(fā) 出波長(zhǎng)為 640 nm的熒光。當(dāng)變性時(shí)，探針游離，兩基 團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能產(chǎn)生 640 nm波長(zhǎng)的熒光。由于 FRET探 針是靠近發(fā)光，所以檢測(cè)的信號(hào)是實(shí)時(shí)信號(hào)，非累積信號(hào)。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理（ FRET） 熒光 FRET探針?lè)ǖ奶攸c(diǎn) A、特異性好； B、 SNP檢測(cè)； C、難設(shè)計(jì)； D、費(fèi)用昂貴。 E、在退火時(shí)搜集熒光信號(hào)。 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的優(yōu)點(diǎn) 1． 特異性好 使用特異性探針對(duì)定量分子進(jìn)行識(shí)別，具有很高的準(zhǔn)確性。同時(shí)， 靶序列由引物和探針雙重控制 (插入染料法除外 )，特異性好，假 陽(yáng)性低。 2．靈敏度高 熒光 PCR檢測(cè)技術(shù)是綜合了 PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、 數(shù)碼顯像技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測(cè)靈敏度很高。 3．線性關(guān)系好、線性范圍寬 由于熒光信號(hào)的產(chǎn)生和每次擴(kuò)增產(chǎn)物成一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，通過(guò)熒光 信號(hào)的檢測(cè)可以直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量；定量范圍可在 0~10 拷貝／ 毫升。 4．操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高、防污染。 擴(kuò)增和檢測(cè)可以在同一管內(nèi)進(jìn)行，不需要開蓋，不易污染；同時(shí)擴(kuò)增 和檢測(cè)一步完成，不需要后期處理，不再需要擔(dān)心 EB和放射性污染。 5．速度快、高通量 可在 2～ 3小時(shí)完成 96個(gè)樣品的定量分析。 10 第四節(jié) 定量 PCR實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) 根據(jù)自己所要研究的基因，在 gene bank中找到相應(yīng) 的基因序列。 應(yīng)用相應(yīng)的引物探針軟件，進(jìn)行引物探針的設(shè)計(jì)。 引物設(shè)計(jì)原則： A、引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)； B、引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)； C、引物設(shè)計(jì)的特異性要好； D、引物長(zhǎng)度通常在 2025bp， Tm值在 55～ 65℃ ， GC含 量在 40～ 60％； E、引物 3’端避免使用堿基 A與出現(xiàn) 3個(gè)以上的連續(xù)堿基； F、為鑒定出現(xiàn)基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨 2個(gè)外 顯子。 探針設(shè)計(jì)原則： A、探針位置盡可能地靠近上游引物； B、探針長(zhǎng)度通常在 2030bp， Tm值在 6570℃ ， 通常比引物高 510 ℃ ， GC含量在 4070％。 C、探針地 5’端應(yīng)避免使用堿基 G； D、整條探針中， C的含量要明顯高于 G地含量； E、設(shè)計(jì)的探針特異性要好。 根據(jù)儀器的特點(diǎn)與要求，選擇不同標(biāo)記的熒光素。 引物與探針的合成及相關(guān)試劑的準(zhǔn)備。 標(biāo)準(zhǔn)品地制備。 先做普通 PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)，找出最佳的 PCR反應(yīng)條件。 PCR反應(yīng)體系：通常使用混合好的試劑，只需加入 引物、探針、模板與 PCR水： MIXTRUE 適量 引物 探針 模板 25ul 水 至 2050ul 以上濃度均為終濃度，插入染料法不需要加入探針。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：根據(jù)情況進(jìn)行 10倍數(shù)的濃度稀釋， 做 3～ 5個(gè)梯度。 樣本的檢測(cè)，每個(gè)樣本做兩個(gè)復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè) 空白對(duì)照。 基線或閾值的設(shè)定。 Lightcycler 熒光定量 PCR系統(tǒng)介紹 機(jī)器構(gòu)造 配件 上機(jī)前操作過(guò)程 準(zhǔn)備反應(yīng)混和物 上機(jī)前離心 將反應(yīng)毛細(xì)管插入反應(yīng)盤中 上機(jī) 實(shí)驗(yàn)完成后傾倒毛細(xì)管的方法 特 點(diǎn) 可使用外標(biāo)法定量，可加內(nèi)對(duì)照，可做熔點(diǎn)曲線分析。 單一光路的三個(gè)檢測(cè)點(diǎn)對(duì)樣本同時(shí)進(jìn)行三個(gè)波長(zhǎng)的熒 光檢測(cè)，擴(kuò)增與檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，提供實(shí)時(shí)分析和在線 監(jiān)測(cè)。引入獨(dú)特的顏色補(bǔ)償試劑和軟件以消除個(gè)檢測(cè) 通道其它染料熒光的干擾。 一次可做 32個(gè)樣本。 共用熱室，保證單次 PCR每個(gè)樣本的狀況連續(xù)一致。循 環(huán)速度快， 2030分鐘完成 3040個(gè)循環(huán)，一次檢測(cè)樣本 數(shù) 32個(gè)。 Lightcycler 熒光定量 PCR系統(tǒng) 清潔和維護(hù) ? 反應(yīng)槽和內(nèi)壁均可用家用洗滌劑清潔，但反應(yīng)槽必須在取出后才能進(jìn)行清潔。 ? 當(dāng)毛細(xì)管破碎時(shí)，首先用儀器廠家提供的毛刷將碎片去除，再用 70%乙醇清洗反應(yīng)槽。 ? 光路部分須用無(wú)水乙醇清潔。 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀的醫(yī)學(xué)應(yīng)用 ? 臨床疾病檢測(cè) 定量分析：各種病毒，細(xì)菌，衣源體，支原體，病毒載量。 Her2基因、白血病融合基因等腫瘤標(biāo)志物基因 檢測(cè)對(duì)疾病進(jìn)行診斷、療效觀察及預(yù)后。 基因分型： 病原耐藥性點(diǎn)突變的檢測(cè) (MGB)、 腫瘤耐藥基因 檢測(cè)，避免盲目用藥。 ? 各種基因的定量表達(dá)分析 : 大樣本量，快速方便，線性范圍寬，重現(xiàn)性好，定量準(zhǔn)確。 ? SNP和基因突變分析： 疾病相關(guān)基因型與臨床表型的關(guān)系 。 SNP檢測(cè)與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性：抗高血壓藥物療效個(gè)體差異、 藥物副反應(yīng)的預(yù)防。 目的 ：利用核酸檢測(cè)，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高靈敏度，為診斷 用藥提供依據(jù)。 方法： 從血液中提取病毒 DNA，擴(kuò)增病毒基因，以 TaqMan探針 進(jìn)行檢測(cè)。 對(duì)照： 濃度為 10 105 、 104 103 的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，設(shè)陰 性和空白對(duì)照。 實(shí)驗(yàn)步驟： 提取 HBV DNA 配制反應(yīng) Mixture，加模板 DNA 上機(jī) 擴(kuò)增 軟件結(jié)果分析 結(jié)果： 獲取血液樣品中 HBVDNA的精確 copy數(shù)。 利用 FRET探針?lè)z測(cè)血液中的 HBV 利用 LightCycler雙探針?lè)? 檢測(cè)血液中的 HBV含量 第一步 編輯反應(yīng)程序 補(bǔ)充說(shuō)明：熒光定量方法不同所選熒光通道不同 程序運(yùn)行界面 結(jié)果分析 熔鏈分析 突變分析 突變分析 TaqMan法在基因表達(dá)研究中的應(yīng)用 應(yīng)用 TaqMan法研究 ERBB2在乳腺腫瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)差異 標(biāo)記探針 使用 TaqMan 探針進(jìn)行雙通道熒光定量 ? Fam標(biāo)記目標(biāo)基因探針 ? VIC標(biāo)記看家基因探針 材料準(zhǔn)備 ?從正常乳腺組織中提取的 總 RNA。 ?從乳腺癌組織中提取的 總 RNA。 ?含 ERBB2 and GAPDH 的 質(zhì) 粒用于生成 標(biāo) 準(zhǔn)曲 線 。 ?單雙通道同時(shí)進(jìn)行，獨(dú)立分析。 ? Controls –no RNA：陰性對(duì)照 –RNA + no reverse transcriptase：基因組對(duì)照 反應(yīng)程序 RTQPCR 反應(yīng)程序： 50186。C,30min 95186。C,15min 94186。C,15sec 60186。C,1min 10186。C,forever 35 more times 癌癥標(biāo)記物表達(dá) Color 2 VIC detection for GAPDH Color 1 – FAM detection for ERBB2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Copies ng/ 181。l Total RNA Healthy RNA Tumor RNA Tumor/Healthy ERBB2 1095 1052 2130 2492 GAPDH 95500 85730 136000 130800 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ERBB2 copies / GAPDH copies 1095 / 95500 = 1052 / 85730 = 2130/136000 = 2492/130800 = Healthy RNA Tumor RNA Graph Copies ng/ 181。l Total RNA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Healthy Tissue Carc. Tissue Relative Expression ERBB2的 表達(dá)差異 討 論 通過(guò) RTQPCR成功檢測(cè)了 ERBB2基因在不同組織的 表達(dá)差異；在乳腺癌組織中， ERBB2的表達(dá)量是正常水平的 。 熒光實(shí)時(shí) 定量中的內(nèi)標(biāo)的作用：常用的內(nèi)標(biāo)有βactin、 GAPDH等看家基因。這些基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)相對(duì)恒定，受環(huán)境因素影響小。內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞的數(shù)量。因此可把目的表達(dá)基因與相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)基因的比值用于消除不同樣品間總 RNA在量上的差異。 SYBR Green I法舉例 利用 SYBR Green 1進(jìn)行 GMO定量 相對(duì)定量中內(nèi)標(biāo)的作用 對(duì)定量中的內(nèi)標(biāo)通常是 β actin、 GAPDH等看家基因。這些基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)相對(duì)恒定，受環(huán)境因素影響小。內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量相。 Lightcycler 熒光定量 PCR系統(tǒng) 原理和特點(diǎn) 可使用外標(biāo)法定量，可加內(nèi)對(duì)照，可做熔點(diǎn)曲線分析。 單一光路的三個(gè)檢測(cè)點(diǎn)對(duì)樣本同時(shí)進(jìn)行三個(gè)波長(zhǎng)的熒 光檢測(cè)，擴(kuò)增與檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，提供實(shí)時(shí)分析和在線監(jiān)測(cè)。引入獨(dú)特的顏色補(bǔ)償試劑和軟件以消除個(gè)檢測(cè)通道其它染 料熒光的干擾。 一次可做 32個(gè)樣本。 共用熱室，保證單次 PCR每個(gè)樣本的狀況連續(xù)一致。循 環(huán)速度快， 2030分鐘完成 3040個(gè)循環(huán)，一次檢測(cè)樣本數(shù) 32個(gè)。 Lightcycler 熒光定量 PCR系統(tǒng) 清潔和維護(hù) ? 反應(yīng)槽和內(nèi)壁均可用家用洗滌劑清潔，但反應(yīng)槽必須在取出后才能進(jìn)行清潔。 ? 當(dāng)毛細(xì)管破碎時(shí)，首先用儀器廠家提供的毛刷將碎片去除，再用 70%乙醇清洗反應(yīng)槽。 ? 光路部分須用無(wú)水乙醇清潔。