熒光定量pcrppt課件-資料下載頁
2025-01-17 18:46本頁面
【正文】 定量數(shù)據(jù)分析 目標(biāo)基因的 CT值 內(nèi)參基因的 CT值 待測樣本的 ΔCT 值 對照樣本的 ΔCT 值 計(jì)算表達(dá)水平比率： 2 –ΔΔCT =表達(dá)量的比值 2△△ Ct 法 目的 基因 內(nèi)參 基因 目的基因 內(nèi)參基因 △ Ct 待測樣本 對照樣本 △△ Ct 倍數(shù)值 fold 2△△ Ct 對照樣本 0 1 待測樣本 Trouble shooting 常見問題 可能原因 解決方法 Housekeeping gene 無信號 RNA降解 用新鮮組織提取 RNA Housekeeping gene 有信號 而目標(biāo)基因無信號 1. 目的基因表達(dá)低。 逆轉(zhuǎn)錄效率不高 2. PCR引物不良 1. 富集 mRNA 2. 在逆轉(zhuǎn)錄中嘗試不同引物，如特異引物。 3. 嘗試不同 PCR引物。減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo) 區(qū)段，考慮不同剪接體。 4. 嘗試不同熱循程序，降低復(fù)性溫度。 Housekeeping gene 反應(yīng)效率正常 ,但 目標(biāo)基因放大效率不高 PCR引物不良 重新設(shè)計(jì)引物，減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo)區(qū)段， 考慮不同剪接體 目標(biāo)基因表達(dá)豐度在 樣本之間異常一致 RNA被基因組 DNA污染 intron 引物 DNase處理 RNA RNA陰性對照表現(xiàn)陰性 溶解曲線出現(xiàn)雜峰 PCR產(chǎn)物 PCR引物 ，升高復(fù)性溫度 ，將檢測溫度設(shè)定在在引物二聚體解鏈溫度與 PCR特異產(chǎn)物解鏈溫度之間。 陰性對照在 30個(gè)循環(huán) 以內(nèi)出現(xiàn)信號 試劑被污染 PCR產(chǎn)物 查找，替換污染試劑 2. 使用 UNG系統(tǒng)。 熒光定量產(chǎn)品 染料法 FastSYBR Mixture UltraSYBR Mixture ?GoldStar Taq ?特異性強(qiáng) ?靈敏度高 ?Ct值更低 ?線性范圍更廣 ?定量更準(zhǔn)確 ?反應(yīng)速度快 ?比普通反應(yīng)可節(jié)省約 40分鐘 ?適合于普通和快速定量 PCR程序 熒光定量產(chǎn)品 染料法 某其它品牌 康為 UltraSYBR cDNA用內(nèi)參 actin引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物片段 100bp。 模板濃度進(jìn)行 10倍稀釋，稀釋 6個(gè)梯度。 康為世紀(jì)產(chǎn)品 RNA Trizol 超純 RNA提取試劑盒 動物組織 RNA 植物 RNA 血液 RNA 病毒 RNA 逆轉(zhuǎn)錄 SuperRT / HiFiMMLV逆轉(zhuǎn)錄酶 cDNA第一鏈合成試劑盒 RTPCR 一步法、兩步法試劑盒 熒光定量 PCR UltraSYBR Mixture FastSYBR Mixture GoldStar Taqman Mixture PCR GoldStar DNA Polymerase Taq /Es Taq DNA Polymerase Taq /Es Taq Master Mix
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