熒光定量pcrppt課件(已修改)
2025-01-29 18:46 本頁面
【正文】 北京康為世紀生物科技有限公司 實時熒光定量 PCR Real Time Quantitative PCR 內(nèi) 容 ?miRNA的特點及檢測 ?熒光定量 PCR檢測 microRNA ? 長度 20～24nt 單鏈小分子 RNA ? 與目標基因 3’端非編碼區(qū)的識別位點相結(jié)合 ? 導致目標基因 mRNA分子穩(wěn)定性下降，半衰期變短，或mRNA分子結(jié)構(gòu)變化（ 5‘脫帽），從而表達水平下降。 3’ AAAAAAAA 5’cap miRNA作用靶點 編碼區(qū) mRNA microRNA分子功能 microRNA 的來源 miRNA前體與成熟體 靶點識別 –不嚴格互補配對 ? 一個 miRNA可調(diào)節(jié)多個基因 ? 一個基因可受多個miRNA調(diào)控 ? 60%人類蛋白基因受miRNA調(diào)控 miRNA 與 siRNA的異同 ? 分子形式無區(qū)別，都是由 Dicer產(chǎn)生的~22nt小分子 ? 分子功能近似，都導致目標基因表達水平下降，但通常 siRNA效果更劇烈 ? 產(chǎn)生來源不同 – miRNA有其基因，內(nèi)源性表達 – siRNA多數(shù)情況下為人工外源導入 miRNA siRNA miRNA 與 siRNA的異同 miRNA 檢測與定量 經(jīng)典方法 : 放射標記 Northern雜交 miRNA芯片 –基因表達譜 ? 基本原理：某物種全部已知 miRNA集中于一張芯片，點雜交檢測各 miRNA豐度 ? 所回答的問題：哪些 miRNA是你所應該關(guān)注的 ? 優(yōu)點：高通量，全景觀察 ? 缺點：敏感度、特異性均有限，適用于初篩 ? 需后續(xù)驗證：熒光定量 PCR PremiRNA檢測 必要性： 不排除 miRNA從前體到 成熟體，從核內(nèi)轉(zhuǎn)運到 核外的過程中存在調(diào)控 機制的可能。 Specific miRNA quantification by real time PCR – way to go 關(guān)鍵難點 ? 豐度低 – 解決辦法 :小 RNA提取 ? 太短 – 解決辦法 : 加長 ? 序列高度相似 miRNA之間難以區(qū)分 – 解決辦法 : 特殊設(shè)計的檢測方法；小心設(shè)計引物與反應優(yōu)化 解決 miRNA豐度難題 基本原理 影響 RNA分子與硅膠柱結(jié)合的因素 ? 離液劑 chaotropic agent，如鹽酸胍 ? 離子強度，如 NaCl ? 小分子有機溶劑，如乙醇 精心調(diào)整各組份配比，達成大、小 RNA與 硅膠柱結(jié)合的區(qū)分條件，分離去除大分子量 RNA，富集小分子量 RNA 小 RNA提取 M 1 2 3 M： Marker 1：康為柱式分離的小片段 RNA 2：康為柱式分離的總 RNA 3：沉淀法得到的總 RNA 提取小分子量 RNA 成熟 miRNA qPCR檢測 Poly(A)加尾法 優(yōu)點： 簡單直接，高效。一次逆轉(zhuǎn) 錄獲得的 cDNA可用于多個 目標分子的檢
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