【正文】 熒光定量熒光定量 PCR技術(shù)講座技術(shù)講座? 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)系列講座分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)系列講座ⅢⅢ 大綱大綱一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計(jì)探針的設(shè)計(jì)三、內(nèi)參基因的選擇三、內(nèi)參基因的選擇四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析PCR技術(shù)技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）? PolymerasechainReaction以目的基因或以目的基因或 DNA片段為模板片段為模板，在引物介導(dǎo)及，在引物介導(dǎo)及 DNA聚合酶聚合酶催化下，在體外用核苷酸（催化下，在體外用核苷酸（dNTP）大量合成目的基因或）大量合成目的基因或DNA片段。片段。? 它能快速、專一地?cái)U(kuò)增所希它能快速、專一地?cái)U(kuò)增所希望得到的目的基因或望得到的目的基因或 DNA片段片段。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR技術(shù)概論技術(shù)概論 熒光定量熒光定量 PCR技術(shù)產(chǎn)生并成熟于上世紀(jì)技術(shù)產(chǎn)生并成熟于上世紀(jì) 90年代，由于該技年代，由于該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，能夠?qū)亩ㄐ缘蕉康娘w躍，能夠?qū)?PCR反應(yīng)的全過程反應(yīng)的全過程進(jìn)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，并且自動(dòng)化程度高，所以該技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在短行實(shí)時(shí)監(jiān)控，并且自動(dòng)化程度高，所以該技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在短短的十幾年時(shí)間，在科研及檢驗(yàn)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用短的十幾年時(shí)間，在科研及檢驗(yàn)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用 ， 成為成為分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR技術(shù)概論技術(shù)概論 熒光定量熒光定量 PCR技術(shù)是在技術(shù)是在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)隨著熒光信號(hào)隨著 PCR反應(yīng)的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)控 PCR反應(yīng)的進(jìn)程，并反應(yīng)的進(jìn)程，并通通過分析軟件對(duì)過分析軟件對(duì) PCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)分析的技術(shù)。的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)分析的技術(shù)。 系統(tǒng)組成：定量系統(tǒng)組成：定量 PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR常用的三個(gè)概念常用的三個(gè)概念 擴(kuò)增曲線、閾值、擴(kuò)增曲線、閾值、 CT值值（（ 1）、擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增曲線的兩種形式）、擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增曲線的兩種形式 左圖反映的是隨著左圖反映的是隨著 PCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號(hào)數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號(hào) 的的 變化量的對(duì)數(shù)與變化量的對(duì)數(shù)與 PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時(shí)具有簡(jiǎn)單明了的特點(diǎn)，所以很多軟件右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時(shí)具有簡(jiǎn)單明了的特點(diǎn)，所以很多軟件都采用右圖的形式，當(dāng)然了，這兩種實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要相互轉(zhuǎn)換都采用右圖的形式，當(dāng)然了，這兩種實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要相互轉(zhuǎn)換。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR常用的三個(gè)概念常用的三個(gè)概念（（ 2）、閾值線）、閾值線 在熒光定量在熒光定量 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，擴(kuò)增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度的差值全部相同。所有樣品的熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度的差值全部相同。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR常用的三個(gè)概念常用的三個(gè)概念（（ 3）、）、 CT值值 PCR過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，所經(jīng)過的過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ) 熒光定量熒光定量 PCR是隨著是隨著 PCR循環(huán)的進(jìn)行，以熒光信號(hào)強(qiáng)度的積循環(huán)的進(jìn)行，以熒光信號(hào)強(qiáng)度的積累來實(shí)時(shí)反映累來實(shí)時(shí)反映 PCR反應(yīng)進(jìn)程的。理想的熒光物質(zhì)需具備以下特反應(yīng)進(jìn)程的。理想的熒光物質(zhì)需具備以下特點(diǎn)：點(diǎn)： （（ 1）、本底低）、本底低（（ 2）、熒光強(qiáng)度高）、熒光強(qiáng)度高（（ 3）、每輪）、每輪 PCR反應(yīng)完成后都有熒光強(qiáng)度的增高，而且這種熒反應(yīng)完成后都有熒光強(qiáng)度的增高，而且這種熒 光強(qiáng)度的增高和每輪循環(huán)后光強(qiáng)度的增高和每輪循環(huán)后 PCR產(chǎn)物的量成線性關(guān)系產(chǎn)物的量成線性關(guān)系（（ 4）、沒有）、沒有 PCR產(chǎn)物時(shí)，沒有熒光產(chǎn)物時(shí)，沒有熒光（（ 5）、該熒光物質(zhì)的受激發(fā)后其發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍窄，各種）、該熒光物質(zhì)的受激發(fā)后其發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍窄，各種 熒光不會(huì)產(chǎn)生熒光的交叉干擾熒光不會(huì)產(chǎn)生熒光的交叉干擾一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)目前常用的幾種熒光物質(zhì)目前常用的幾種熒光物質(zhì)（（ 1）、）、 Taqman探針類探針類5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，端標(biāo)記熒光基團(tuán)， 3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，沒有端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，沒有熒光，探針斷裂后，在激發(fā)光的作用下，熒光基團(tuán)產(chǎn)生熒光熒光，探針斷裂后，在激發(fā)光的作用下，熒光基團(tuán)產(chǎn)生熒光；；探針本身序列與目的基因序列互補(bǔ)，特異性高，退火后探針探針本身序列與目的基因序列互補(bǔ)，特異性高，退火后探針與目的基因互補(bǔ)序列結(jié)合，隨著與目的基因互補(bǔ)序列結(jié)合，隨著 PCR反應(yīng)的進(jìn)行，在反應(yīng)的進(jìn)行，在 Taq酶酶 5’3’外切酶的作用下，探針?biāo)鈹嗔眩瑹晒猱a(chǎn)生。外切酶的作用下，探針?biāo)鈹嗔?，熒光產(chǎn)生。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)Taqman常用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)常用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán) 熒光基團(tuán)：熒光基團(tuán)： 5’端常用熒光基團(tuán)端常用熒光基團(tuán) FAM標(biāo)記，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)：標(biāo)記，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)： 494495nm，最，最大大 發(fā)射光波長(zhǎng)：發(fā)射光波長(zhǎng)： 518520nm。淬滅基團(tuán)：淬滅基團(tuán)： TAMRA、 BHQ、 ECLIPSE等。等。 TAMRA本身也是一種熒光基團(tuán)，激發(fā)光波長(zhǎng)范圍較寬，本身也是一種熒光基團(tuán)，激發(fā)光波長(zhǎng)范圍較寬， 500—— 560nm，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)在，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)在 560nm附近，對(duì)附近，對(duì) FAM基團(tuán)產(chǎn)生的發(fā)射光基團(tuán)產(chǎn)生的發(fā)射光 具有較好的吸收作用；其發(fā)射光波長(zhǎng)較寬，具有較好的吸收作用；其發(fā)射光波長(zhǎng)較寬， 560—— 650nm，當(dāng)做，當(dāng)做 多重?zé)晒鈺r(shí)，容易產(chǎn)生熒光交叉干擾，并且本底較高，故現(xiàn)已多重?zé)晒鈺r(shí)，容易產(chǎn)生熒光交叉干擾，并且本底較高，故現(xiàn)已 不常用。不常用。 BHQ和和 ECLIPSE為非熒光物質(zhì)，只是一種熒光淬滅劑，本身不會(huì)為非熒光物質(zhì)，只是一種熒光淬滅劑，本身不會(huì) 產(chǎn)生熒光，光吸收范圍較寬，因此本底較低，作為淬滅基團(tuán)較產(chǎn)生熒光，光吸收范圍較寬，因此本底較低，作為淬滅基團(tuán)較 為常用，尤其在多重?zé)晒舛繛槌Ｓ?，尤其在多重?zé)晒舛?PCR時(shí)常常被采用。時(shí)常常被采用。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)Taqman探針的特點(diǎn)及應(yīng)用探針的特點(diǎn)及應(yīng)用（（ 1）、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高）、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高 本身具有序列特異性，保證了所檢測(cè)目的基因的特異本身具有序列特異性，保證了所檢測(cè)目的基因的特異 性；其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)保證了其所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與性；其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)保證了其所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與 PCR產(chǎn)物產(chǎn)物 的量成正比關(guān)系，因此準(zhǔn)確性極高。的量成正比關(guān)系，因此準(zhǔn)確性極高。（（ 2）、對(duì)引物及試劑要求不高，配套的普通引物就可以使）、對(duì)引物及試劑要求不高，配套的普通引物就可以使 用，普通的用，普通的 Taq酶就能滿足實(shí)驗(yàn)的要求。酶就能滿足實(shí)驗(yàn)的要求。（（ 3）、常被用作基因含量的精確檢測(cè)）、常被用作基因含量的精確檢測(cè) (精確度可達(dá)幾十個(gè)拷貝精確度可達(dá)幾十個(gè)拷貝 ) 及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá)及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá) 化）?；?。（（ 4）、目前價(jià)格也不是太貴，）、目前價(jià)格也不是太貴， 2OD 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)（（ 2）、熒光染料類）、熒光染料類 目前常用的熒光染料為目前常用的熒光染料為 SYBR GreenⅠⅠ 、 SYBR GreenⅡⅡ 、 SYTO HRM等。其共同性質(zhì)為：等。其共同性質(zhì)為： （（ a）、結(jié)合于雙鏈核酸的小溝處）、結(jié)合于雙鏈核酸的小溝處 （（ b）、與雙鏈）、與雙鏈 DNA結(jié)合后受激產(chǎn)生熒光結(jié)合后受激產(chǎn)生熒光 （（ c）、在變性條件下雙鏈分開，熒光消失）、在變性條件下雙鏈分開，熒光消失一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)熒光染料的特點(diǎn)及應(yīng)用熒光染料的特點(diǎn)及應(yīng)用（（ 1）、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后產(chǎn)生熒光，其熒光的強(qiáng)度與）、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后產(chǎn)生熒光，其熒光的強(qiáng)度與 雙鏈核酸的含量及長(zhǎng)度成正比，因此本底較高；雙鏈核酸的含量及長(zhǎng)度成正比，因此本底較高；（（ 2）、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；）、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；（（ 3）、）、 SYBR GreenⅠⅠ 染料本身價(jià)格便宜，但是做熒光定量染料本身價(jià)格便宜，但是做熒光定量 PCR時(shí)對(duì)引物設(shè)時(shí)對(duì)引物設(shè) 計(jì)的要求很高；對(duì)計(jì)的要求很高；對(duì) Taq酶要求較高，最好是酶要求較高，最好是 HotStar Taq酶，或者操酶，或者操 作時(shí)需要嚴(yán)格的冷啟動(dòng)，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴(kuò)作時(shí)需要嚴(yán)格的冷啟動(dòng)，冰上操作