【正文】 假如這個污染屬于是頑固的未知污染，可以用正常樣品測得的初始模板量減去 227，來避免污染引起的誤差八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將得到的結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)在很多軟件都帶有結(jié)果的自動分實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將得到的結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)在很多軟件都帶有結(jié)果的自動分析功能，可以將結(jié)果直接轉(zhuǎn)化為各種圖表及柱狀圖。產(chǎn)物污染的有效辦法，但是成本較高。前了，由熔解曲線可知對于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。要想達(dá)到這個目實(shí)驗(yàn)，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯誤。因種類相對較多的實(shí)驗(yàn)。四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化如何優(yōu)化、如何優(yōu)化SYBR GreenⅠⅠ 反應(yīng)體系中反應(yīng)體系中 Mg2＋濃度梯度優(yōu)化＋濃度梯度優(yōu)化 PCR電泳結(jié)果電泳結(jié)果四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化如何優(yōu)化、如何優(yōu)化優(yōu)化后的 Taqman探針體系實(shí)驗(yàn)結(jié)果， Mg2＋濃度為＋濃度為，引物濃度為左右，引物濃度為 500nM，探針濃度為，探針濃度為 250nM。內(nèi)參分析軟件來選擇合適的內(nèi)參基因。的表達(dá)水平也不同。影響。 在在 Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)過程中，引物的探針及引物的設(shè)計(jì)過程中，引物的 TM值已經(jīng)確定為值已經(jīng)確定為 60℃℃ 左左右，在每輪右，在每輪 PCR循環(huán)的復(fù)性過程中（循環(huán)的復(fù)性過程中（ 95→→ 60℃℃ ），為了確保探針先于引物），為了確保探針先于引物與與模板結(jié)合，這就要求探針的模板結(jié)合，這就要求探針的 TM值高于引物值高于引物 10℃℃ 左右，所以左右，所以 Taqman探針及探針及引引物一般都是引物物一般都是引物 TM值為值為 60℃℃ 左右，探針的左右，探針的 TM值為值為 70℃℃ 左右。 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的特點(diǎn)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的特點(diǎn) ：： （（ a）、考慮到了不同基因擴(kuò)增效率的差異，用標(biāo)準(zhǔn)曲線來校正擴(kuò)增效）、考慮到了不同基因擴(kuò)增效率的差異，用標(biāo)準(zhǔn)曲線來校正擴(kuò)增效 率，最大限度的避免了誤差；率，最大限度的避免了誤差； （（ b）、思路直觀、條理清晰、應(yīng)用簡便，操作靈活，無需像）、思路直觀、條理清晰、應(yīng)用簡便，操作靈活，無需像 Delta delta CT法那樣對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行反復(fù)的優(yōu)化；法那樣對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行反復(fù)的優(yōu)化； （（ c）、其不足之處是每次實(shí)驗(yàn)都必需對目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲）、其不足之處是每次實(shí)驗(yàn)都必需對目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲 線；線； （（ d）、該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)操作中，由于樣品選取時樣品的細(xì)胞個數(shù)不可能完全相同，實(shí)驗(yàn)操作中，由于樣品選取時樣品的細(xì)胞個數(shù)不可能完全相同， RNA提取提取時得率不同、時得率不同、 RNA反轉(zhuǎn)錄為反轉(zhuǎn)錄為 cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會用一些看內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成究中都會用一些看內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 使用熒光染料作為熒光基團(tuán)時，由于熒光染料的特性隨著使用熒光染料作為熒光基團(tuán)時，由于熒光染料的特性隨著 PCR反應(yīng)的進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，雙鏈行，雙鏈 PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，產(chǎn)物呈指數(shù)增長， SYBR GreenⅠⅠ 與雙鏈與雙鏈 PCR產(chǎn)物結(jié)合后熒光越產(chǎn)物結(jié)合后熒光越來越強(qiáng)，當(dāng)來越強(qiáng)，當(dāng) PCR反應(yīng)結(jié)束時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，此時對反應(yīng)結(jié)束時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，此時對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行緩慢產(chǎn)物進(jìn)行緩慢加熱，從加熱，從 50℃℃ 一直加熱到一直加熱到 99℃℃ ，在此過程中，在此過程中 PCR產(chǎn)物按照產(chǎn)物按照 TM值的大小雙鏈值的大小雙鏈被被依次打開，熒光強(qiáng)度也隨著雙鏈的打開依次減弱，如下圖：依次打開，熒光強(qiáng)度也隨著雙鏈的打開依次減弱，如下圖：一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 對于核酸序列相同的對于核酸序列相同的 PCR產(chǎn)物，其產(chǎn)物，其 TM值也相同，而且其值也相同，而且其 TM值在一個很小值在一個很小的溫度范圍內(nèi)，在此溫度區(qū)間，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光強(qiáng)的溫度范圍內(nèi)，在此溫度區(qū)間，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光強(qiáng)度急劇降低，以熒光強(qiáng)度的變化率和溫度來作圖，則可得到如下圖：度急劇降低，以熒光強(qiáng)度的變化率和溫度來作圖，則可得到如下圖： 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 上圖就是熔解曲線，熔解曲線反映的是一定序列長度的核上圖就是熔解曲線，熔解曲線反映的是一定序列長度的核酸雙鏈，在一定的離子強(qiáng)度下的酸雙鏈，在一定的離子強(qiáng)度下的 TM值。對數(shù)全部一致，都達(dá)到了閾值。（（ 4）、目前價格也不是太貴，）、目前價格也不是太貴， 2OD 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)（（ 2）、熒光染料類）、熒光染料類 目前常用的熒光染料為目前常用的熒光染料為 SYBR GreenⅠⅠ 、 SYBR GreenⅡⅡ 、 SYTO HRM等。 BHQ和和 ECLIPSE為非熒光物質(zhì)，只是一種熒光淬滅劑，本身不會為非熒光物質(zhì)，只是一種熒光淬滅劑，本身不會 產(chǎn)生熒光，光吸收范圍較寬，因此本底較低，作為淬滅基團(tuán)較產(chǎn)生熒光，光吸收范圍較寬，因此本底較低，作為淬滅基團(tuán)較 為常用，尤其在多重?zé)晒舛繛槌Ｓ?，尤其在多重?zé)晒舛?PCR時常常被采用。理想的熒光物質(zhì)需具備以下特反應(yīng)進(jìn)程的。 系統(tǒng)組成：定量系統(tǒng)組成：定量 PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。Reaction以目的基因或以目的基因或 DNA片段為模板片段為模板，在引物介導(dǎo)及，在引物介導(dǎo)及 分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR常用的三個概念常用的三個概念（（ 3）、）、 CT值值 PCR過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時，所經(jīng)過的過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時，所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。等。酶就能滿足實(shí)驗(yàn)的要求。反應(yīng)的效率。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR線性關(guān)系成立的條件分析線性關(guān)系成立的條件分析左圖橫坐標(biāo)是左圖橫坐標(biāo)是 PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度 Rn，改圖反映的是各個樣品隨，改圖反映的是各個樣品隨著每輪著每輪 PCR反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時變化；右圖橫坐標(biāo)也是反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時變化；右圖橫坐標(biāo)也是 PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值是總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值 RT –RB即即 △△ Rn的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直線上所有樣品的直線上所有樣品的 RT –RB的對數(shù)都相同，熒光定量的對數(shù)都相同，熒光定量 PCR的線性關(guān)系才會成立。曲同工之處。法。 該方法特別適合于樣品量不大，但是檢測的基因種類很多的情況。 95℃℃ ， 20s， 60℃℃ ， 20s， 40個個 cycles；看熒光本底和；看熒光本底和 熒光強(qiáng)度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著熒光強(qiáng)度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著 PCR反應(yīng)，熒反應(yīng)，熒 光強(qiáng)度不會變化，假如熒光強(qiáng)度變化的比較大，說明探針合成質(zhì)量光強(qiáng)度不會變化，假如熒光強(qiáng)度變化的比較大，說明探針合成質(zhì)量 較差，建議重新合成。三、內(nèi)參基因的選擇三、內(nèi)參基因的選擇常用內(nèi)參基因的表達(dá)情況、常用內(nèi)參基因的表達(dá)情況（（ 1）、）、 GAPDH GAPDH mRNA在不同癌組織在不同癌組織 (包括肺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌等包括肺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌等 )中的表達(dá)中的表達(dá)升高，在不同個體間、懷孕期間以及細(xì)胞周期的不同階段等變化很大，在升高，在不同個體間、懷孕期間以及細(xì)胞周期的不同階段等變化很大，在正常的結(jié)腸上皮、人類前列腺癌的細(xì)胞周期不同階段也呈現(xiàn)出顯著性變正常的結(jié)腸上皮、人類前列腺癌的細(xì)胞周期不同階段也呈現(xiàn)出顯著性變化。三、內(nèi)參基因的選擇三、內(nèi)參基因的選擇內(nèi)參基因的選擇策略、內(nèi)參基因的選擇策略 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，不同組織、不同細(xì)胞、細(xì)胞的不同生理時期、根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，不同組織、不同細(xì)胞、細(xì)胞的不同生理時期、不同的理化條件刺激等，查閱相關(guān)資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做不同的理化條件刺激等，查閱相關(guān)資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做熒光定量熒光定量 PCR，先以，先以 CT值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與其其相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說明該基因相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說明該基因表達(dá)穩(wěn)定，適合作為理想的內(nèi)參。普通普通 PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 模板模板 引物引物 Taq酶酶 Buffer Mg2＋＋ 水水定量 PCR反應(yīng)體系 模板模板 引物引物 熒光基團(tuán)熒光基團(tuán) Taq酶酶 Buffer Mg2＋＋ 水水四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系、為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系普通 PCR結(jié)果電泳圖 添加熒光基團(tuán)后 PCR結(jié)果電泳圖四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化如何優(yōu)化、如何優(yōu)化 由上圖可知，添加熒光基團(tuán)后，由上圖可知，添加熒光基團(tuán)后， PCR的反應(yīng)效率幾乎為的反應(yīng)效率幾乎為 0，所以必須對，所以必須對熒光定量熒光定量 PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，對體系中各個反應(yīng)成分的濃度進(jìn)行調(diào)整。（（ 3）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法適合樣品量大、檢測的基因種類相對較少、精度要求）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法適合樣品量大、檢測的基因種類相對較少、精度要求 較高的實(shí)驗(yàn)。（（ 2）、儀器設(shè)備引起的誤差）、儀器設(shè)備引起的誤差 測量標(biāo)準(zhǔn)品核酸濃度時，分光光度計(jì)的誤差，從光密度值到質(zhì)量再測量標(biāo)準(zhǔn)品核酸濃度時，分光光度計(jì)的誤差，從光密度值到質(zhì)量再 到摩爾量，誤差本身就很大（雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法不一定非