【正文】 ，否則引物二聚體及非特異性擴 增會嚴重干擾結果的準確性，尤其是模板含量較低時；增會嚴重干擾結果的準確性，尤其是模板含量較低時；（（ 4）、適合于基因含量及基因表達變化的粗略分析或初篩；）、適合于基因含量及基因表達變化的粗略分析或初篩；（（ 5）、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。）、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。（（ 6）、對）、對 PCR反應的毒性，能抑制反應的毒性，能抑制 PCR反應，降低反應，降低 PCR反應的效率。反應的效率。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR的數學原理的數學原理 對于普通的對于普通的 PCR反應來說反應來說 n Xn=X0（（ 1＋＋ E））上式中，上式中， Xn為為 n輪輪 PCR循環(huán)后，目的基因循環(huán)后，目的基因 PCR產物的量；產物的量； n為為PCR循環(huán)數；循環(huán)數； X0 為目的基因的初始模板量，為目的基因的初始模板量， E為為 PCR的反應效的反應效率，率， 0≤E≤1。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR的數學原理的數學原理 由于由于 PCR反應體系中熒光物質的熒光強度與反應體系中熒光物質的熒光強度與 PCR產物的量成正比，所以產物的量成正比，所以用熒光強度來代替用熒光強度來代替 PCR產物的量，我們可以得到：產物的量，我們可以得到： Rn= RB+ X0(1+ E) Rsn總熒光信號強度總熒光信號強度 =本底信號本底信號 +分子數量分子數量 單位信號強度單位信號強度Rn：： 第第 n個循環(huán)時的總信號個循環(huán)時的總信號RB：： 本底本底RS：： 單位信號強度單位信號強度X0：： 起始起始 DNA數目數目E：： PCR效率效率一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR的數學原理的數學原理 當循環(huán)數當循環(huán)數 n等于等于 CT值時，所有樣品熒光信號強度變化量的值時，所有樣品熒光信號強度變化量的對數全部一致，都達到了閾值。對數全部一致，都達到了閾值。 RT= RB+ X0(1+ E) Rs lg(RT RB) = lgX0 + CT lg(1+ E) + lg Rs CT lg(1+ E) = lgX0 + lg(RT RB) –lg Rs 此時，此時， PCR反應處于指數期階段，所有樣品的反應效率反應處于指數期階段，所有樣品的反應效率 E穩(wěn)定且近似相穩(wěn)定且近似相等；等； lg(RT RB)、 Rs也都相同，只有也都相同，只有 CT值和值和 lgX0為變量，且這兩個變?yōu)樽兞?，且這兩個變量之間成一次性方程。量之間成一次性方程。 也就是說，也就是說， 所有樣品的所有樣品的 lgX0與到達閾值時的循環(huán)數與到達閾值時的循環(huán)數 n（（ Ct值）呈線性值）呈線性關系，根據樣品擴增達到域值的循環(huán)數即關系，根據樣品擴增達到域值的循環(huán)數即 Ct值就可計算出樣品中所含的模值就可計算出樣品中所含的模板量板量CT一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR線性關系成立的條件分析線性關系成立的條件分析CT lg(1+ E) = lgX0 + lg(RT RB) –lg Rs（（ 1）、）、 PCR效率相等，在效率相等，在 PCR擴增的指數期，擴增的指數期， E穩(wěn)定且為常數；穩(wěn)定且為常數；（（ 2）、）、 RT –RB 要要 相等；也就是說到達閾值時樣品的熒光強度與樣品的熒相等；也就是說到達閾值時樣品的熒光強度與樣品的熒 光本底之差要相等；光本底之差要相等；（（ 3）、樣品的單位信號強度）、樣品的單位信號強度 Rs要相等，用熒光染料做熒光基團時，要相等，用熒光染料做熒光基團時， Rs 就就 是每條是每條 PCR產物結合熒光染料后所發(fā)出的熒光強度，此熒光強度和產物結合熒光染料后所發(fā)出的熒光強度，此熒光強度和 PCR產物的長短有關，產物的長短有關， PCR產物越長，結合的熒光染料越多，產物越長，結合的熒光染料越多， Rs 值值 越大；用探針做熒光基團時，越大；用探針做熒光基團時， Rs 就等于就等于 PCR反應時，反應時， Taq酶水解掉酶水解掉 探針，探針的發(fā)光基團所發(fā)出的熒光強度，和探針，探針的發(fā)光基團所發(fā)出的熒光強度，和 PCR產物的長度沒有產物的長度沒有 直接關系。直接關系。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR線性關系成立的條件分析線性關系成立的條件分析左圖橫坐標是左圖橫坐標是 PCR循環(huán)次數，縱坐標是總的熒光強度循環(huán)次數，縱坐標是總的熒光強度 Rn，改圖反映的是各個樣品隨，改圖反映的是各個樣品隨著每輪著每輪 PCR反應，其總的熒光量的實時變化；右圖橫坐標也是反應，其總的熒光量的實時變化；右圖橫坐標也是 PCR循環(huán)次數，縱坐標循環(huán)次數，縱坐標是總的熒光強度與熒光本底的差值是總的熒光強度與熒光本底的差值 RT –RB即即 △△ Rn的對數，在右圖中確定閾值線，該的對數，在右圖中確定閾值線，該直線上所有樣品的直線上所有樣品的 RT –RB的對數都相同，熒光定量的對數都相同，熒光定量 PCR的線性關系才會成立。的線性關系才會成立。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR線性關系成立的條件分析線性關系成立的條件分析 LogX0與循環(huán)數呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，根據未知樣品 Ct值，就可以在標準曲線上計算出未知樣品初始模板量。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 使用熒光染料作為熒光基團時，由于熒光染料的特性隨著使用熒光染料作為熒光基團時，由于熒光染料的特性隨著 PCR反應的進反應的進行，雙鏈行，雙鏈 PCR產物呈指數增長，產物呈指數增長， SYBR GreenⅠⅠ 與雙鏈與雙鏈 PCR產物結合后熒光越產物結合后熒光越來越強，當來越強，當 PCR反應結束時，熒光強度達到最大，此時對反應結束時，熒光強度達到最大，此時對 PCR產物進行緩慢產物進行緩慢加熱，從加熱，從 50℃℃ 一直加熱到一直加熱到 99℃℃ ，在此過程中，在此過程中 PCR產物按照產物按照 TM值的大小雙鏈值的大小雙鏈被被依次打開，熒光強度也隨著雙鏈的打開依次減弱，如下圖：依次打開，熒光強度也隨著雙鏈的打開依次減弱，如下圖：一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 對于核酸序列相同的對于核酸序列相同的 PCR產物，其產物，其 TM值也相同，而且其值也相同，而且其 TM值在一個很小值在一個很小的溫度范圍內，在此溫度區(qū)間，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光強的溫度范圍內，在此溫度區(qū)間，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光強度急劇降低，以熒光強度的變化率和溫度來作圖，則可得到如下圖：度急劇降低，以熒光強度的變化率和溫度來作圖，則可得到如下圖： 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 上圖就是熔解曲線，熔解曲線反映的是一定序列長度的核上圖就是熔解曲線，熔解曲線反映的是一定序列長度的核酸雙鏈，在一定的離子強度下的酸雙鏈，在一定的離子強度下的 TM值。核酸雙鏈的值。核酸雙鏈的 TM值由雙值由雙鏈鏈核苷酸之間相連接的氫鍵決定，不同的核酸雙鏈，其核苷酸之間相連接的氫鍵決定，不同的核酸雙鏈，其 TM值也不值也不同，所以通過熔解曲線，我們能獲知雙鏈核酸的均一性、野生同，所以通過熔解曲線，我們能獲知雙鏈核酸的均一性、野生型和突變型雙鏈之間的堿基差異等，如果采用高分辨率熒光染型和突變型雙鏈之間的堿基差異等，如果采用高分辨率熒光染料，鏈條核酸雙鏈哪怕只有一個堿基的差異，通過熔解曲線也料，鏈條核酸雙鏈哪怕只有一個堿基的差異，通過熔解曲線也能分析出來。能分析出來。 電泳是通過核酸分子量的大小和構象來分析的，熔解曲線電泳是通過核酸分子量的大小和構象來分析的，熔解曲線是根據雙鏈核酸的是根據雙鏈核酸的 TM值來分析的，這與瓊脂糖電泳及值來分析的，這與瓊脂糖電泳及 SSCP有有異異曲同工之處。曲同工之處。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論絕對定量和相對定量、絕對定量和相對定量一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論 mRNA差異表達的相對定量分析差異表達的相對定量分析 研究基因表達的情況，我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化研究基因表達的情況，我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化趨勢如何就行了，而無需知道該基因的絕對量有多少。趨勢如何就行了，而無需知道該基因的絕對量有多少。 實驗操作中，由于樣品選取時樣品的細胞個數不可能完全相同，實驗操作中，由于樣品選取時樣品的細胞個數不可能完全相同， RNA提取提取時得率不同、時得率不同、 RNA反轉錄為反轉錄為 cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進行基因表達調控研始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進行基因表達調控研究中都會用一些看內參基因來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成究中都會用一些看內參基因來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的內參基因是在各種生理條件下表達量恒定的基因，這些基的差異。常用的內參基因是在各種生理條件下表達量恒定的基因，這些基因也常被稱為看家基因，該基因表達一般不隨外界的變化而變化，所以常因也常被稱為看家基因，該基因表達一般不隨外界的變化而變化，所以常被用作內參照，常用的內參基因有被用作內參照，常用的內參基因有 GAPDH基因、基因、 βActin基因，基因， 18srRNA基基因等。因等。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論 mRNA差異表達的相對定量分析差異表達的相對定量分析以上公式就是引入內參基因后相對定量分析的基本公式，并由此派生出兩以上公式就是引入內參基因后相對定量分析的基本公式，并由此派生出兩種相對定量的分析方法種相對定量的分析方法 ：： 雙標準曲線法和雙標準曲線法和 Deltadelta Ct法。法。一、熒光定量一