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熒光定量pcr技術(shù)講座:理論基礎(chǔ)、引物及探針設(shè)計、體系優(yōu)化、實驗方案、數(shù)據(jù)分析、污染防控(存儲版)

2025-06-24 22:11上一頁面

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【正文】 要測標(biāo)準(zhǔn)品的到摩爾量,誤差本身就很大(雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法不一定非要測標(biāo)準(zhǔn)品的 濃度);濃度); 定量定量 PCR儀的誤差儀的誤差 耗材引起的誤差,耗材引起的誤差, 96空板封口膜透光性的差異等空板封口膜透光性的差異等六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范誤差分析、誤差分析(( 3)、相對定量時內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差)、相對定量時內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差(( 4)、操作引起的誤差)、操作引起的誤差 樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣,操作過程中引起的誤樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣,操作過程中引起的誤 差。如測定一種藥物 到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響,必須做到每次飼喂時此藥品完全被小白到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響,必須做到每次飼喂時此藥品完全被小白 鼠攝食;選取試驗樣品時,要保證選取的組織盡可能的純,不要污鼠攝食;選取試驗樣品時,要保證選取的組織盡可能的純,不要污 染其他組織,如選取脾臟組織時,盡可能的選取脾臟,不能混有結(jié)染其他組織,如選取脾臟組織時,盡可能的選取脾臟,不能混有結(jié) 締組織等,樣品選取好后,即可放入液氮或超低溫冰箱保存。(( 5)、做定量)、做定量 PCR時,先把除模板外的所有試劑預(yù)混,然后分裝到時,先把除模板外的所有試劑預(yù)混,然后分裝到 PCR管管 中,分裝時盡量采用排槍,加樣時盡量最好采用排槍。六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范操作規(guī)范、操作規(guī)范同一 cDNA樣品的三個重復(fù)六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范模板濃度越低,染料法的誤差越大。(( 3)、高濃度的樣品引起的污染)、高濃度的樣品引起的污染 高濃度的陽性樣品在加樣過程中可能會形成氣溶膠,造成污染。七、實驗中污染的防控七、實驗中污染的防控?zé)晒舛俊晒舛?PCR實驗中污染的防控實驗中污染的防控(( 4)、對于未知污染源的頑固的污染的防控)、對于未知污染源的頑固的污染的防控 這類污染也經(jīng)常出現(xiàn),找不到明確的污染源,而且此類污染又非常這類污染也經(jīng)常出現(xiàn),找不到明確的污染源,而且此類污染又非常 頑固,對于這種情況,最好的辦法就是不去管它,在采用絕對定量頑固,對于這種情況,最好的辦法就是不去管它,在采用絕對定量 和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法時,污染的初始模板量可由陰性對照檢測出來,知和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法時,污染的初始模板量可由陰性對照檢測出來,知 道了污染的初始模板量后,我們可以把測得樣品的初始模板量減去道了污染的初始模板量后,我們可以把測得樣品的初始模板量減去 污染的初始模板量,在分析時就避免了污染造成的誤差。比較大的樣品,需重復(fù)實驗。(( 3)、對于樣品間的檢查污染)、對于樣品間的檢查污染 樣品間的交叉污染往往是因為高濃度的樣品在加樣室形成了氣溶樣品間的交叉污染往往是因為高濃度的樣品在加樣室形成了氣溶 膠,因為樣品的膠,因為樣品的 cDNA鏈較長,經(jīng)常開紫外燈,把長鏈鏈較長,經(jīng)常開紫外燈,把長鏈 cDNA打斷,能打斷,能 有效避免此類污染的發(fā)生,另外保持加樣室空氣流通也有助于防止有效避免此類污染的發(fā)生,另外保持加樣室空氣流通也有助于防止 此類污染。(( 2)、標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染)、標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染 常用的標(biāo)準(zhǔn)品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的常用的標(biāo)準(zhǔn)品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的 PCR產(chǎn)物等,由于產(chǎn)物等,由于 標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的,所以在稀釋過程中,標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的,所以在稀釋過程中, 有可能引起污染。 同一個同一個 cDNA樣品做三個重復(fù)定量檢測求平均值主要是消除加樣時的樣品做三個重復(fù)定量檢測求平均值主要是消除加樣時的 誤差,排槍加樣時,誤差很小,加樣時的誤差可以通過設(shè)幾個重復(fù)誤差,排槍加樣時,誤差很小,加樣時的誤差可以通過設(shè)幾個重復(fù) 檢測出來。(( 4)、對于精度要求較高的定量)、對于精度要求較高的定量 PCR,最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做,最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析,找出表達(dá)恒定基因作為內(nèi)參。(( 1)、樣品的處理及選?。?、樣品的處理及選取 處理樣品時,必須確保樣品都得到了充分的處理。六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范誤差分析、誤差分析(( 1)、實驗方案本身的誤差)、實驗方案本身的誤差 熒光染料法由于染料本身的特性,不可避免的會引起誤差;熒光染料法由于染料本身的特性,不可避免的會引起誤差; 2 △△△△ CT法由于也是一種近似的算法,所以不可避免的也會引起法由于也是一種近似的算法,所以不可避免的也會引起 誤差;誤差; Taqman探針法誤差相對較??;探針法誤差相對較??; 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法誤差相對較小。(( 2)、探針法適合常被用作基因含量的精確檢測)、探針法適合常被用作基因含量的精確檢測 (精確度可達(dá)幾十個拷貝精確度可達(dá)幾十個拷貝 ) 及基因表達(dá)變化的精確分析(精確度可達(dá)及基因表達(dá)變化的精確分析(精確度可達(dá) )。 四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系、為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系 與普通與普通 PCR反應(yīng)相比,熒光定量反應(yīng)相比,熒光定量 PCR在反應(yīng)中加入了熒光物質(zhì),用以實在反應(yīng)中加入了熒光物質(zhì),用以實時顯示反應(yīng)的進(jìn)程,時顯示反應(yīng)的進(jìn)程, Taqman探針法在普通探針法在普通 PCR反應(yīng)體系中加入了與擴(kuò)增片反應(yīng)體系中加入了與擴(kuò)增片段段互補(bǔ)的一段帶熒光標(biāo)記的核酸序列,互補(bǔ)的一段帶熒光標(biāo)記的核酸序列, Taq酶除了酶除了 5’3’聚合酶作用之外,還要聚合酶作用之外,還要發(fā)揮發(fā)揮 5′3′外切酶的活性來水解探針鏈來產(chǎn)生熒光;外切酶的活性來水解探針鏈來產(chǎn)生熒光; SybrGreen法加入了法加入了能與雙鏈核酸結(jié)合的熒光染料,這些熒光物質(zhì)都能影響能與雙鏈核酸結(jié)合的熒光染料,這些熒光物質(zhì)都能影響 Taq酶的活性進(jìn)而影酶的活性進(jìn)而影響響 PCR的反應(yīng)效率。(( 3)、)、 18srRNA 當(dāng)細(xì)胞有絲分裂時,當(dāng)細(xì)胞有絲分裂時, 18srRNA表達(dá)量顯著上調(diào)。盲目地使用一種看家基因作為內(nèi)參,一方面可能使基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn),另一種看家基因作為內(nèi)參,一方面可能使基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn),另一方面可能引致錯誤甚至相反的結(jié)論。分析,引物和探針特異性較好。而且在接下來的實驗中,無需再做標(biāo)準(zhǔn)品。因等。能分析出來。 也就是說,也就是說, 所有樣品的所有樣品的 lgX0與到達(dá)閾值時的循環(huán)數(shù)與到達(dá)閾值時的循環(huán)數(shù) n(( Ct值)呈線性值)呈線性關(guān)系,根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即關(guān)系,根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即 Ct值就可計算出樣品中所含的模值就可計算出樣品中所含的模板量板量CT一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR線性關(guān)系成立的條件分析線性關(guān)系成立的條件分析CT lg(1+ E) = lgX0 + lg(RT RB) –lg Rs(( 1)、)、 PCR效率相等,在效率相等,在 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期,擴(kuò)增的指數(shù)期, E穩(wěn)定且為常數(shù);穩(wěn)定且為常數(shù);(( 2)、)、 RT –RB 要要 相等;也就是說到達(dá)閾值時樣品的熒光強(qiáng)度與樣品的熒相等;也就是說到達(dá)閾值時樣品的熒光強(qiáng)度與樣品的熒 光本底之差要相等;光本底之差要相等;(( 3)、樣品的單位信號強(qiáng)度)、樣品的單位信號強(qiáng)度 Rs要相等,用熒光染料做熒光基團(tuán)時,要相等,用熒光染料做熒光基團(tuán)時, Rs 就就 是每條是每條 PCR產(chǎn)物結(jié)合熒光染料后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度,此熒光強(qiáng)度和產(chǎn)物結(jié)合熒光染料后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度,此熒光強(qiáng)度和 PCR產(chǎn)物的長短有關(guān),產(chǎn)物的長短有關(guān), PCR產(chǎn)物越長,結(jié)合的熒光染料越多,產(chǎn)物越長,結(jié)合的熒光染料越多, Rs 值值 越大;用探針做熒光基團(tuán)時,越大;用探針做熒光基團(tuán)時, Rs 就等于就等于 PCR反應(yīng)時,反應(yīng)時, Taq酶水解掉酶水解掉 探針,探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度,和探針,探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度,和 PCR產(chǎn)物的長度沒有產(chǎn)物的長度沒有 直接關(guān)系。)、在分析的基因種類很多,但是樣品量很少時,尤其適用。的量成正比關(guān)系,因此準(zhǔn)確性極高。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)Taqman常用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)常用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán) 熒光基團(tuán):熒光基團(tuán): 5’端常用熒光基團(tuán)端常用熒光基團(tuán) FAM標(biāo)記,最佳激發(fā)光波長:標(biāo)記,最佳激發(fā)光波長: 494495nm,最,最大大 發(fā)射光波長:發(fā)射光波長: 518520nm。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR常用的三個概念常用的三個概念(( 2)、閾值線)、閾值線 在熒光定量在熒光定量 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期,畫一條線,在此直線上,擴(kuò)增的指數(shù)期,畫一條線,在此直線上,所有樣品的熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度的差值全部相同。? 它能快速、專一地擴(kuò)增所希它能快速、專一地擴(kuò)增所希望得到的目的基因或望得到的目的基因或 DNA片段片段。片段。 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR常用的三個概念常用的三個概念 擴(kuò)增曲線、閾值、擴(kuò)增曲線、閾值、 CT值值(( 1)、擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增曲線的兩種形式)、擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增曲線的兩種形式 左圖反映的是隨著左圖反映的是隨著 PCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號的變化,比較直觀,但是指反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號的變化,比較直觀,但是指數(shù)期很短;右圖反映的是熒光信號數(shù)期很短;右圖反映的是熒光信號 的的 變化量的對數(shù)與變化量的對數(shù)與 PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系,從反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系,從右圖可知,指數(shù)期很明顯,在確定閾值線時具有簡單明了的特點,所以很多軟件右圖可知,指數(shù)期很明顯,在確定閾值線時具有簡單明了的特點,所以很多軟件都采用右圖的形式,當(dāng)然了,這兩種實時擴(kuò)增曲線可以根據(jù)實驗的需要相互轉(zhuǎn)換都采用右圖的形式,當(dāng)然了,這兩種實時擴(kuò)增曲線可以根據(jù)實驗的需要相互轉(zhuǎn)換。外切酶的作用下,探針?biāo)鈹嗔眩瑹晒猱a(chǎn)生。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PC
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