【正文】 要測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的到摩爾量，誤差本身就很大（雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法不一定非要測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的 濃度）；濃度）； 定量定量 PCR儀的誤差儀的誤差 耗材引起的誤差，耗材引起的誤差， 96空板封口膜透光性的差異等空板封口膜透光性的差異等六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范誤差分析、誤差分析（（ 3）、相對(duì)定量時(shí)內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差）、相對(duì)定量時(shí)內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差（（ 4）、操作引起的誤差）、操作引起的誤差 樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過(guò)程中引起的誤樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過(guò)程中引起的誤 差。如測(cè)定一種藥物 到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時(shí)此藥品完全被小白到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時(shí)此藥品完全被小白 鼠攝食；選取試驗(yàn)樣品時(shí)，要保證選取的組織盡可能的純，不要污鼠攝食；選取試驗(yàn)樣品時(shí)，要保證選取的組織盡可能的純，不要污 染其他組織，如選取脾臟組織時(shí)，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié)染其他組織，如選取脾臟組織時(shí)，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié) 締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。（（ 5）、做定量）、做定量 PCR時(shí)，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到時(shí)，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到 PCR管管 中，分裝時(shí)盡量采用排槍?zhuān)訕訒r(shí)盡量最好采用排槍。六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范操作規(guī)范、操作規(guī)范同一 cDNA樣品的三個(gè)重復(fù)六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范模板濃度越低，染料法的誤差越大。（（ 3）、高濃度的樣品引起的污染）、高濃度的樣品引起的污染 高濃度的陽(yáng)性樣品在加樣過(guò)程中可能會(huì)形成氣溶膠，造成污染。七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控?zé)晒舛?、熒光定?PCR實(shí)驗(yàn)中污染的防控實(shí)驗(yàn)中污染的防控（（ 4）、對(duì)于未知污染源的頑固的污染的防控）、對(duì)于未知污染源的頑固的污染的防控 這類(lèi)污染也經(jīng)常出現(xiàn)，找不到明確的污染源，而且此類(lèi)污染又非常這類(lèi)污染也經(jīng)常出現(xiàn)，找不到明確的污染源，而且此類(lèi)污染又非常 頑固，對(duì)于這種情況，最好的辦法就是不去管它，在采用絕對(duì)定量頑固，對(duì)于這種情況，最好的辦法就是不去管它，在采用絕對(duì)定量 和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法時(shí)，污染的初始模板量可由陰性對(duì)照檢測(cè)出來(lái)，知和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法時(shí)，污染的初始模板量可由陰性對(duì)照檢測(cè)出來(lái)，知 道了污染的初始模板量后，我們可以把測(cè)得樣品的初始模板量減去道了污染的初始模板量后，我們可以把測(cè)得樣品的初始模板量減去 污染的初始模板量，在分析時(shí)就避免了污染造成的誤差。比較大的樣品，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。（（ 3）、對(duì)于樣品間的檢查污染）、對(duì)于樣品間的檢查污染 樣品間的交叉污染往往是因?yàn)楦邼舛鹊臉悠吩诩訕邮倚纬闪藲馊軜悠烽g的交叉污染往往是因?yàn)楦邼舛鹊臉悠吩诩訕邮倚纬闪藲馊? 膠，因?yàn)闃悠返哪z，因?yàn)闃悠返?cDNA鏈較長(zhǎng)，經(jīng)常開(kāi)紫外燈，把長(zhǎng)鏈鏈較長(zhǎng)，經(jīng)常開(kāi)紫外燈，把長(zhǎng)鏈 cDNA打斷，能打斷，能 有效避免此類(lèi)污染的發(fā)生，另外保持加樣室空氣流通也有助于防止有效避免此類(lèi)污染的發(fā)生，另外保持加樣室空氣流通也有助于防止 此類(lèi)污染。（（ 2）、標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染）、標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染 常用的標(biāo)準(zhǔn)品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的常用的標(biāo)準(zhǔn)品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的 PCR產(chǎn)物等，由于產(chǎn)物等，由于 標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的，所以在稀釋過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的，所以在稀釋過(guò)程中， 有可能引起污染。 同一個(gè)同一個(gè) cDNA樣品做三個(gè)重復(fù)定量檢測(cè)求平均值主要是消除加樣時(shí)的樣品做三個(gè)重復(fù)定量檢測(cè)求平均值主要是消除加樣時(shí)的 誤差，排槍加樣時(shí)，誤差很小，加樣時(shí)的誤差可以通過(guò)設(shè)幾個(gè)重復(fù)誤差，排槍加樣時(shí)，誤差很小，加樣時(shí)的誤差可以通過(guò)設(shè)幾個(gè)重復(fù) 檢測(cè)出來(lái)。（（ 4）、對(duì)于精度要求較高的定量）、對(duì)于精度要求較高的定量 PCR，最好先在樣品的所有組織類(lèi)型內(nèi)做，最好先在樣品的所有組織類(lèi)型內(nèi)做 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達(dá)恒定基因作為內(nèi)參。（（ 1）、樣品的處理及選?。?、樣品的處理及選取 處理樣品時(shí)，必須確保樣品都得到了充分的處理。六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范誤差分析、誤差分析（（ 1）、實(shí)驗(yàn)方案本身的誤差）、實(shí)驗(yàn)方案本身的誤差 熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會(huì)引起誤差；熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會(huì)引起誤差； 2 △△△△ CT法由于也是一種近似的算法，所以不可避免的也會(huì)引起法由于也是一種近似的算法，所以不可避免的也會(huì)引起 誤差；誤差； Taqman探針?lè)ㄕ`差相對(duì)較?。惶结?lè)ㄕ`差相對(duì)較??； 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法誤差相對(duì)較小。（（ 2）、探針?lè)ㄟm合常被用作基因含量的精確檢測(cè)）、探針?lè)ㄟm合常被用作基因含量的精確檢測(cè) (精確度可達(dá)幾十個(gè)拷貝精確度可達(dá)幾十個(gè)拷貝 ) 及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá)及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá) ）。 四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系、為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系 與普通與普通 PCR反應(yīng)相比，熒光定量反應(yīng)相比，熒光定量 PCR在反應(yīng)中加入了熒光物質(zhì)，用以實(shí)在反應(yīng)中加入了熒光物質(zhì)，用以實(shí)時(shí)顯示反應(yīng)的進(jìn)程，時(shí)顯示反應(yīng)的進(jìn)程， Taqman探針?lè)ㄔ谄胀ㄌ结樂(lè)ㄔ谄胀?PCR反應(yīng)體系中加入了與擴(kuò)增片反應(yīng)體系中加入了與擴(kuò)增片段段互補(bǔ)的一段帶熒光標(biāo)記的核酸序列，互補(bǔ)的一段帶熒光標(biāo)記的核酸序列， Taq酶除了酶除了 5’3’聚合酶作用之外，還要聚合酶作用之外，還要發(fā)揮發(fā)揮 5′3′外切酶的活性來(lái)水解探針鏈來(lái)產(chǎn)生熒光；外切酶的活性來(lái)水解探針鏈來(lái)產(chǎn)生熒光； SybrGreen法加入了法加入了能與雙鏈核酸結(jié)合的熒光染料，這些熒光物質(zhì)都能影響能與雙鏈核酸結(jié)合的熒光染料，這些熒光物質(zhì)都能影響 Taq酶的活性進(jìn)而影酶的活性進(jìn)而影響響 PCR的反應(yīng)效率。（（ 3）、）、 18srRNA 當(dāng)細(xì)胞有絲分裂時(shí)，當(dāng)細(xì)胞有絲分裂時(shí)， 18srRNA表達(dá)量顯著上調(diào)。盲目地使用一種看家基因作為內(nèi)參，一方面可能使基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另一種看家基因作為內(nèi)參，一方面可能使基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另一方面可能引致錯(cuò)誤甚至相反的結(jié)論。分析，引物和探針特異性較好。而且在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，無(wú)需再做標(biāo)準(zhǔn)品。因等。能分析出來(lái)。 也就是說(shuō)，也就是說(shuō)， 所有樣品的所有樣品的 lgX0與到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)與到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù) n（（ Ct值）呈線(xiàn)性值）呈線(xiàn)性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即 Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量板量CT一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR線(xiàn)性關(guān)系成立的條件分析線(xiàn)性關(guān)系成立的條件分析CT lg(1+ E) = lgX0 + lg(RT RB) –lg Rs（（ 1）、）、 PCR效率相等，在效率相等，在 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，擴(kuò)增的指數(shù)期， E穩(wěn)定且為常數(shù)；穩(wěn)定且為常數(shù)；（（ 2）、）、 RT –RB 要要 相等；也就是說(shuō)到達(dá)閾值時(shí)樣品的熒光強(qiáng)度與樣品的熒相等；也就是說(shuō)到達(dá)閾值時(shí)樣品的熒光強(qiáng)度與樣品的熒 光本底之差要相等；光本底之差要相等；（（ 3）、樣品的單位信號(hào)強(qiáng)度）、樣品的單位信號(hào)強(qiáng)度 Rs要相等，用熒光染料做熒光基團(tuán)時(shí)，要相等，用熒光染料做熒光基團(tuán)時(shí)， Rs 就就 是每條是每條 PCR產(chǎn)物結(jié)合熒光染料后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，此熒光強(qiáng)度和產(chǎn)物結(jié)合熒光染料后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，此熒光強(qiáng)度和 PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)短有關(guān)，產(chǎn)物的長(zhǎng)短有關(guān)， PCR產(chǎn)物越長(zhǎng)，結(jié)合的熒光染料越多，產(chǎn)物越長(zhǎng)，結(jié)合的熒光染料越多， Rs 值值 越大；用探針做熒光基團(tuán)時(shí)，越大；用探針做熒光基團(tuán)時(shí)， Rs 就等于就等于 PCR反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)時(shí)， Taq酶水解掉酶水解掉 探針，探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，和探針，探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，和 PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度沒(méi)有產(chǎn)物的長(zhǎng)度沒(méi)有 直接關(guān)系。）、在分析的基因種類(lèi)很多，但是樣品量很少時(shí)，尤其適用。的量成正比關(guān)系，因此準(zhǔn)確性極高。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)Taqman常用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)常用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán) 熒光基團(tuán)：熒光基團(tuán)： 5’端常用熒光基團(tuán)端常用熒光基團(tuán) FAM標(biāo)記，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)：標(biāo)記，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)： 494495nm，最，最大大 發(fā)射光波長(zhǎng)：發(fā)射光波長(zhǎng)： 518520nm。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR常用的三個(gè)概念常用的三個(gè)概念（（ 2）、閾值線(xiàn)）、閾值線(xiàn) 在熒光定量在熒光定量 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，畫(huà)一條線(xiàn)，在此直線(xiàn)上，擴(kuò)增的指數(shù)期，畫(huà)一條線(xiàn)，在此直線(xiàn)上，所有樣品的熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度的差值全部相同。? 它能快速、專(zhuān)一地?cái)U(kuò)增所希它能快速、專(zhuān)一地?cái)U(kuò)增所希望得到的目的基因或望得到的目的基因或 DNA片段片段。片段。 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR常用的三個(gè)概念常用的三個(gè)概念 擴(kuò)增曲線(xiàn)、閾值、擴(kuò)增曲線(xiàn)、閾值、 CT值值（（ 1）、擴(kuò)增曲線(xiàn)及擴(kuò)增曲線(xiàn)的兩種形式）、擴(kuò)增曲線(xiàn)及擴(kuò)增曲線(xiàn)的兩種形式 左圖反映的是隨著左圖反映的是隨著 PCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號(hào)數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號(hào) 的的 變化量的對(duì)數(shù)與變化量的對(duì)數(shù)與 PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線(xiàn)時(shí)具有簡(jiǎn)單明了的特點(diǎn)，所以很多軟件右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線(xiàn)時(shí)具有簡(jiǎn)單明了的特點(diǎn)，所以很多軟件都采用右圖的形式，當(dāng)然了，這兩種實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線(xiàn)可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要相互轉(zhuǎn)換都采用右圖的形式，當(dāng)然了，這兩種實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線(xiàn)可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要相互轉(zhuǎn)換。外切酶的作用下，探針?biāo)鈹嗔?，熒光產(chǎn)生。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PC