【正文】 環(huán)數；循環(huán)數； X0 為目的基因的初始模板量，為目的基因的初始模板量， E為為 PCR的反應效的反應效率，率， 0≤E≤1。其共同性質為： （（ a）、結合于雙鏈核酸的小溝處）、結合于雙鏈核酸的小溝處 （（ b）、與雙鏈）、與雙鏈 DNA結合后受激產生熒光結合后受激產生熒光 （（ c）、在變性條件下雙鏈分開，熒光消失）、在變性條件下雙鏈分開，熒光消失一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學基礎的化學基礎熒光染料的特點及應用熒光染料的特點及應用（（ 1）、能夠與所有的核酸雙鏈結合，受激后產生熒光，其熒光的強度與）、能夠與所有的核酸雙鏈結合，受激后產生熒光，其熒光的強度與 雙鏈核酸的含量及長度成正比，因此本底較高；雙鏈核酸的含量及長度成正比，因此本底較高；（（ 2）、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；）、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；（（ 3）、）、 SYBR GreenⅠⅠ 染料本身價格便宜，但是做熒光定量染料本身價格便宜，但是做熒光定量 PCR時對引物設時對引物設 計的要求很高；對計的要求很高；對 Taq酶要求較高，最好是酶要求較高，最好是 HotStar Taq酶，或者操酶，或者操 作時需要嚴格的冷啟動，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴作時需要嚴格的冷啟動，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴 增會嚴重干擾結果的準確性，尤其是模板含量較低時；增會嚴重干擾結果的準確性，尤其是模板含量較低時；（（ 4）、適合于基因含量及基因表達變化的粗略分析或初篩；）、適合于基因含量及基因表達變化的粗略分析或初篩；（（ 5）、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。（（ 3）、常被用作基因含量的精確檢測）、常被用作基因含量的精確檢測 (精確度可達幾十個拷貝精確度可達幾十個拷貝 ) 及基因表達變化的精確分析（精確度可達及基因表達變化的精確分析（精確度可達 化）。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學基礎的化學基礎Taqman探針的特點及應用探針的特點及應用（（ 1）、特異性強、準確性高）、特異性強、準確性高 本身具有序列特異性，保證了所檢測目的基因的特異本身具有序列特異性，保證了所檢測目的基因的特異 性；其結構特點保證了其所產生的熒光強度與性；其結構特點保證了其所產生的熒光強度與 PCR產物產物 的量成正比關系，因此準確性極高。 TAMRA本身也是一種熒光基團，激發(fā)光波長范圍較寬，本身也是一種熒光基團，激發(fā)光波長范圍較寬， 500—— 560nm，最佳激發(fā)光波長在，最佳激發(fā)光波長在 560nm附近，對附近，對 FAM基團產生的發(fā)射光基團產生的發(fā)射光 具有較好的吸收作用；其發(fā)射光波長較寬，具有較好的吸收作用；其發(fā)射光波長較寬， 560—— 650nm，當做，當做 多重熒光時，容易產生熒光交叉干擾，并且本底較高，故現已多重熒光時，容易產生熒光交叉干擾，并且本底較高，故現已 不常用。外切酶的作用下，探針水解斷裂，熒光產生。擴增循環(huán)數。 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR常用的三個概念常用的三個概念 擴增曲線、閾值、擴增曲線、閾值、 CT值值（（ 1）、擴增曲線及擴增曲線的兩種形式）、擴增曲線及擴增曲線的兩種形式 左圖反映的是隨著左圖反映的是隨著 PCR反應的進行相應的熒光信號的變化，比較直觀，但是指反應的進行相應的熒光信號的變化，比較直觀，但是指數期很短；右圖反映的是熒光信號數期很短；右圖反映的是熒光信號 的的 變化量的對數與變化量的對數與 PCR反應循環(huán)數的關系，從反應循環(huán)數的關系，從右圖可知，指數期很明顯，在確定閾值線時具有簡單明了的特點，所以很多軟件右圖可知，指數期很明顯，在確定閾值線時具有簡單明了的特點，所以很多軟件都采用右圖的形式，當然了，這兩種實時擴增曲線可以根據實驗的需要相互轉換都采用右圖的形式，當然了，這兩種實時擴增曲線可以根據實驗的需要相互轉換。 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR技術概論技術概論 熒光定量熒光定量 PCR技術是在技術是在 PCR反應體系中加入熒光基團，利用反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號隨著熒光信號隨著 PCR反應的積累來實時監(jiān)控反應的積累來實時監(jiān)控 PCR反應的進程，并反應的進程，并通通過分析軟件對過分析軟件對 PCR的反應進行檢測分析的技術。片段。PCR技術技術（聚合酶鏈式反應）（聚合酶鏈式反應）? Polymerase熒光定量熒光定量 PCR技術講座技術講座? 分子生物學實驗技術系列講座分子生物學實驗技術系列講座ⅢⅢ 大綱大綱一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論二、引物及二、引物及 Taqman探針的設計探針的設計三、內參基因的選擇三、內參基因的選擇四、反應體系的優(yōu)化四、反應體系的優(yōu)化五、實驗方案的選擇五、實驗方案的選擇六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范七、實驗中污染的防控七、實驗中污染的防控八、實驗結果的分析八、實驗結果的分析chain? 它能快速、專一地擴增所希它能快速、專一地擴增所希望得到的目的基因或望得到的目的基因或 DNA片段片段。的反應進行檢測分析的技術。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR常用的三個概念常用的三個概念（（ 2）、閾值線）、閾值線 在熒光定量在熒光定量 PCR擴增的指數期，畫一條線，在此直線上，擴增的指數期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強度與其本底熒光強度的差值全部相同。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學基礎的化學基礎 熒光定量熒光定量 PCR是隨著是隨著 PCR循環(huán)的進行，以熒光信號強度的積循環(huán)的進行，以熒光信號強度的積累來實時反映累來實時反映 PCR反應進程的。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學基礎的化學基礎Taqman常用的熒光基團和淬滅基團常用的熒光基團和淬滅基團 熒光基團：熒光基團： 5’端常用熒光基團端常用熒光基團 FAM標記，最佳激發(fā)光波長：標記，最佳激發(fā)光波長： 494495nm，最，最大大 發(fā)射光波長：發(fā)射光波長： 518520nm。不常用。的量成正比關系，因此準確性極高?；?。）、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR的數學原理的數學原理 由于由于 PCR反應體系中熒光物質的熒光強度與反應體系中熒光物質的熒光強度與 PCR產物的量成正比，所以產物的量成正比，所以用熒光強度來代替用熒光強度來代替 PCR產物的量，我們可以得到：產物的量，我們可以得到： Rn= RB+ X0(1+ E) Rsn總熒光信號強度總熒光信號強度 =本底信號本底信號 +分子數量分子數量 單位信號強度單位信號強度Rn：： 第第 n個循環(huán)時的總信號個循環(huán)時的總信號RB：： 本底本底RS：： 單位信號強度單位信號強度X0：： 起始起始 DNA數目數目E：： PCR效率效率一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR的數學原理的數學原理 當循環(huán)數當循環(huán)數 n等于等于 CT值時，所有樣品熒光信號強度變化量的值時，所有樣品熒光信號強度變化量的對數全部一致，都達到了閾值。 也就是說，也就是說， 所有樣品的所有樣品的 lgX0與到達閾值時的循環(huán)數與到達閾值時的循環(huán)數 n（（ Ct值）呈線性值）呈線性關系，根據樣品擴增達到域值的循環(huán)數即關系，根據樣品擴增達到域值的循環(huán)數即 Ct值就可計算出樣品中所含的模值就可計算出樣品中所含的模板量板量CT一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR線性關系成立的條件分析線性關系成立的條件分析CT lg(1+ E) = lgX0 + lg(RT RB) –lg Rs（（ 1）、）、 PCR效率相等，在效率相等，在 PCR擴增的指數期，擴增的指數期， E穩(wěn)定且為常數；穩(wěn)定且為常數；（（ 2）、）、 RT –RB 要要 相等；也就是說到達閾值時樣品的熒光強度與樣品的熒相等；也就是說到達閾值時樣品的熒光強度與樣品的熒 光本底之差要相等；光本底之差要相等；（（ 3）、樣品的單位信號強度）、樣品的單位信號強度 Rs要相等，用熒光染料做熒光基團時，要相等，用熒光染料做熒光基團時， Rs 就就 是每條是每條 PCR產物結合熒光染料后所發(fā)出的熒光強度，此熒光強度和產物結合熒光染料后所發(fā)出的熒光強度，此熒光強度和 PCR產物的長短有關，產物的長短有關， PCR產物越長，結合的熒光染料越多，產物越長，結合的熒光染料越多， Rs 值值 越大；用探針做熒光基團時，越大；用探針做熒光基團時， Rs 就等于就等于 PCR反應時，反應時， Taq酶水解掉酶水解掉 探針，探針的發(fā)光基團所發(fā)出的熒光強度，和探針，探針的發(fā)光基團所發(fā)出的熒光強度，和 PCR產物的長度沒有產物的長度沒有 直接關系。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論熒光定量、熒光定量 PCR線性關系成立的條件分析線性關系成立的條件分析 LogX0與循環(huán)數呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，根據未知樣品 Ct值，就可以在標準曲線上計算出未知樣品初始模板量。能分析出來。趨勢如何就行了，而無需知道該基因的絕對量有多少。因等。定量的基本公式來求出目的基因的差異表達。而且在接下來的實驗中，無需再做標準品。復性延伸。分析，引物和探針特異性較好。三、內參基因的選擇三、內參基因的選擇理想的內參基因具有的特點、理想的內參基因具有的特點（（ 1）、不存在假基因；）、不存在假基因；（（ 2）、高度或中度表達，排除太高或低表達）、高度或中度表達，排除太高或低表達（（ 3）、穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織）、穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織 (如正常細胞和癌細胞如正常