【正文】 環(huán)數(shù)；循環(huán)數(shù)； X0 為目的基因的初始模板量，為目的基因的初始模板量， E為為 PCR的反應(yīng)效的反應(yīng)效率，率， 0≤E≤1。其共同性質(zhì)為： （（ a）、結(jié)合于雙鏈核酸的小溝處）、結(jié)合于雙鏈核酸的小溝處 （（ b）、與雙鏈）、與雙鏈 DNA結(jié)合后受激產(chǎn)生熒光結(jié)合后受激產(chǎn)生熒光 （（ c）、在變性條件下雙鏈分開，熒光消失）、在變性條件下雙鏈分開，熒光消失一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)熒光染料的特點(diǎn)及應(yīng)用熒光染料的特點(diǎn)及應(yīng)用（（ 1）、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后產(chǎn)生熒光，其熒光的強(qiáng)度與）、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后產(chǎn)生熒光，其熒光的強(qiáng)度與 雙鏈核酸的含量及長(zhǎng)度成正比，因此本底較高；雙鏈核酸的含量及長(zhǎng)度成正比，因此本底較高；（（ 2）、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；）、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；（（ 3）、）、 SYBR GreenⅠⅠ 染料本身價(jià)格便宜，但是做熒光定量染料本身價(jià)格便宜，但是做熒光定量 PCR時(shí)對(duì)引物設(shè)時(shí)對(duì)引物設(shè) 計(jì)的要求很高；對(duì)計(jì)的要求很高；對(duì) Taq酶要求較高，最好是酶要求較高，最好是 HotStar Taq酶，或者操酶，或者操 作時(shí)需要嚴(yán)格的冷啟動(dòng)，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴(kuò)作時(shí)需要嚴(yán)格的冷啟動(dòng)，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴(kuò) 增會(huì)嚴(yán)重干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其是模板含量較低時(shí)；增會(huì)嚴(yán)重干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其是模板含量較低時(shí)；（（ 4）、適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；）、適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；（（ 5）、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時(shí)，尤其適用。（（ 3）、常被用作基因含量的精確檢測(cè)）、常被用作基因含量的精確檢測(cè) (精確度可達(dá)幾十個(gè)拷貝精確度可達(dá)幾十個(gè)拷貝 ) 及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá)及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá) 化）。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)Taqman探針的特點(diǎn)及應(yīng)用探針的特點(diǎn)及應(yīng)用（（ 1）、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高）、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高 本身具有序列特異性，保證了所檢測(cè)目的基因的特異本身具有序列特異性，保證了所檢測(cè)目的基因的特異 性；其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)保證了其所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與性；其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)保證了其所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與 PCR產(chǎn)物產(chǎn)物 的量成正比關(guān)系，因此準(zhǔn)確性極高。 TAMRA本身也是一種熒光基團(tuán)，激發(fā)光波長(zhǎng)范圍較寬，本身也是一種熒光基團(tuán)，激發(fā)光波長(zhǎng)范圍較寬， 500—— 560nm，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)在，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)在 560nm附近，對(duì)附近，對(duì) FAM基團(tuán)產(chǎn)生的發(fā)射光基團(tuán)產(chǎn)生的發(fā)射光 具有較好的吸收作用；其發(fā)射光波長(zhǎng)較寬，具有較好的吸收作用；其發(fā)射光波長(zhǎng)較寬， 560—— 650nm，當(dāng)做，當(dāng)做 多重?zé)晒鈺r(shí)，容易產(chǎn)生熒光交叉干擾，并且本底較高，故現(xiàn)已多重?zé)晒鈺r(shí)，容易產(chǎn)生熒光交叉干擾，并且本底較高，故現(xiàn)已 不常用。外切酶的作用下，探針?biāo)鈹嗔?，熒光產(chǎn)生。擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR常用的三個(gè)概念常用的三個(gè)概念 擴(kuò)增曲線、閾值、擴(kuò)增曲線、閾值、 CT值值（（ 1）、擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增曲線的兩種形式）、擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增曲線的兩種形式 左圖反映的是隨著左圖反映的是隨著 PCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號(hào)數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號(hào) 的的 變化量的對(duì)數(shù)與變化量的對(duì)數(shù)與 PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時(shí)具有簡(jiǎn)單明了的特點(diǎn)，所以很多軟件右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時(shí)具有簡(jiǎn)單明了的特點(diǎn)，所以很多軟件都采用右圖的形式，當(dāng)然了，這兩種實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要相互轉(zhuǎn)換都采用右圖的形式，當(dāng)然了，這兩種實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要相互轉(zhuǎn)換。 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR技術(shù)概論技術(shù)概論 熒光定量熒光定量 PCR技術(shù)是在技術(shù)是在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)隨著熒光信號(hào)隨著 PCR反應(yīng)的積累來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)的積累來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控 PCR反應(yīng)的進(jìn)程，并反應(yīng)的進(jìn)程，并通通過(guò)分析軟件對(duì)過(guò)分析軟件對(duì) PCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)分析的技術(shù)。片段。PCR技術(shù)技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）? Polymerase熒光定量熒光定量 PCR技術(shù)講座技術(shù)講座? 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)系列講座分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)系列講座ⅢⅢ 大綱大綱一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計(jì)探針的設(shè)計(jì)三、內(nèi)參基因的選擇三、內(nèi)參基因的選擇四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析chain? 它能快速、專一地?cái)U(kuò)增所希它能快速、專一地?cái)U(kuò)增所希望得到的目的基因或望得到的目的基因或 DNA片段片段。的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)分析的技術(shù)。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR常用的三個(gè)概念常用的三個(gè)概念（（ 2）、閾值線）、閾值線 在熒光定量在熒光定量 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，擴(kuò)增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度的差值全部相同。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ) 熒光定量熒光定量 PCR是隨著是隨著 PCR循環(huán)的進(jìn)行，以熒光信號(hào)強(qiáng)度的積循環(huán)的進(jìn)行，以熒光信號(hào)強(qiáng)度的積累來(lái)實(shí)時(shí)反映累來(lái)實(shí)時(shí)反映 PCR反應(yīng)進(jìn)程的。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)Taqman常用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)常用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán) 熒光基團(tuán)：熒光基團(tuán)： 5’端常用熒光基團(tuán)端常用熒光基團(tuán) FAM標(biāo)記，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)：標(biāo)記，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)： 494495nm，最，最大大 發(fā)射光波長(zhǎng)：發(fā)射光波長(zhǎng)： 518520nm。不常用。的量成正比關(guān)系，因此準(zhǔn)確性極高?；?。）、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時(shí)，尤其適用。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理 由于由于 PCR反應(yīng)體系中熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)體系中熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度與 PCR產(chǎn)物的量成正比，所以產(chǎn)物的量成正比，所以用熒光強(qiáng)度來(lái)代替用熒光強(qiáng)度來(lái)代替 PCR產(chǎn)物的量，我們可以得到：產(chǎn)物的量，我們可以得到： Rn= RB+ X0(1+ E) Rsn總熒光信號(hào)強(qiáng)度總熒光信號(hào)強(qiáng)度 =本底信號(hào)本底信號(hào) +分子數(shù)量分子數(shù)量 單位信號(hào)強(qiáng)度單位信號(hào)強(qiáng)度Rn：： 第第 n個(gè)循環(huán)時(shí)的總信號(hào)個(gè)循環(huán)時(shí)的總信號(hào)RB：： 本底本底R(shí)S：： 單位信號(hào)強(qiáng)度單位信號(hào)強(qiáng)度X0：： 起始起始 DNA數(shù)目數(shù)目E：： PCR效率效率一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理 當(dāng)循環(huán)數(shù)當(dāng)循環(huán)數(shù) n等于等于 CT值時(shí)，所有樣品熒光信號(hào)強(qiáng)度變化量的值時(shí)，所有樣品熒光信號(hào)強(qiáng)度變化量的對(duì)數(shù)全部一致，都達(dá)到了閾值。 也就是說(shuō)，也就是說(shuō)， 所有樣品的所有樣品的 lgX0與到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)與到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù) n（（ Ct值）呈線性值）呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即 Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量板量CT一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR線性關(guān)系成立的條件分析線性關(guān)系成立的條件分析CT lg(1+ E) = lgX0 + lg(RT RB) –lg Rs（（ 1）、）、 PCR效率相等，在效率相等，在 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，擴(kuò)增的指數(shù)期， E穩(wěn)定且為常數(shù)；穩(wěn)定且為常數(shù)；（（ 2）、）、 RT –RB 要要 相等；也就是說(shuō)到達(dá)閾值時(shí)樣品的熒光強(qiáng)度與樣品的熒相等；也就是說(shuō)到達(dá)閾值時(shí)樣品的熒光強(qiáng)度與樣品的熒 光本底之差要相等；光本底之差要相等；（（ 3）、樣品的單位信號(hào)強(qiáng)度）、樣品的單位信號(hào)強(qiáng)度 Rs要相等，用熒光染料做熒光基團(tuán)時(shí)，要相等，用熒光染料做熒光基團(tuán)時(shí)， Rs 就就 是每條是每條 PCR產(chǎn)物結(jié)合熒光染料后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，此熒光強(qiáng)度和產(chǎn)物結(jié)合熒光染料后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，此熒光強(qiáng)度和 PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)短有關(guān)，產(chǎn)物的長(zhǎng)短有關(guān)， PCR產(chǎn)物越長(zhǎng)，結(jié)合的熒光染料越多，產(chǎn)物越長(zhǎng)，結(jié)合的熒光染料越多， Rs 值值 越大；用探針做熒光基團(tuán)時(shí)，越大；用探針做熒光基團(tuán)時(shí)， Rs 就等于就等于 PCR反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)時(shí)， Taq酶水解掉酶水解掉 探針，探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，和探針，探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，和 PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度沒(méi)有產(chǎn)物的長(zhǎng)度沒(méi)有 直接關(guān)系。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR線性關(guān)系成立的條件分析線性關(guān)系成立的條件分析 LogX0與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品 Ct值，就可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出未知樣品初始模板量。能分析出來(lái)。趨勢(shì)如何就行了，而無(wú)需知道該基因的絕對(duì)量有多少。因等。定量的基本公式來(lái)求出目的基因的差異表達(dá)。而且在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，無(wú)需再做標(biāo)準(zhǔn)品。復(fù)性延伸。分析，引物和探針特異性較好。三、內(nèi)參基因的選擇三、內(nèi)參基因的選擇理想的內(nèi)參基因具有的特點(diǎn)、理想的內(nèi)參基因具有的特點(diǎn)（（ 1）、不存在假基因；）、不存在假基因；（（ 2）、高度或中度表達(dá)，排除太高或低表達(dá)）、高度或中度表達(dá)，排除太高或低表達(dá)（（ 3）、穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織）、穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織 (如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞如正常