熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學生講課hcmv-文庫吧
2024-12-22 08:24 本頁面
【正文】 特異性很差 。 Taq酶的發(fā)現(xiàn) ? 美國的嗜熱菌研究室在黃石國家公園溫泉中發(fā)現(xiàn)了嗜熱菌 (Thermus aquaticus)株， Cetus公司研究人員從中分離了 Taq DNA聚合酶 ? 特點：①耐高溫： 70℃ 2h 活性 90%， 93℃ 2h 活性 60%， 95℃ 2h 活性 40% ； ②延伸溫度較高 (一般為 72 ℃ )：大大 提高了擴增特異性、靈敏性和擴增效率 。 熒光定量 PCR ? 概念：在 PCR反應(yīng)中加入 熒光基團 ，利用熒光信號累積或變化實時監(jiān)測 整個反應(yīng)過程，最后通過特定數(shù)學模型對未知模板進行定量分析的方法。 ? 實時熒光定量 PCR技術(shù)于 1996年由美國 Applied Biosystems， ABI公司 推出，實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍。 實時熒光定量 PCR的原理 ? 利用 熒光信號的變化 實時監(jiān)測 PCR反應(yīng)的每個循環(huán)的擴增產(chǎn)物量的變化。 ? 通過 Ct值 和 標準曲線分析 對起始標本的模板量進行定量分析。 與普通 PCR的比較 ? 普通 PCR完成后，一般只對擴增的最終產(chǎn)物量進行分析，分析結(jié)果多為 定性或者半定量 結(jié)果。 ? 熒光定量 PCR通過監(jiān)測熒光值的變化，體現(xiàn)每一個循環(huán)的擴增產(chǎn)物量的變化，分析結(jié)果為 定量 結(jié)果。 與普通 PCR的比較 ? 普通 PCR完成后，才能進行擴增產(chǎn)物的分析，而且分析的過程可能產(chǎn)生一定的生物危害和環(huán)境污染 。 ? 熒光定量 PCR的擴增和產(chǎn)物分析過程是同時完成 的，而且在 封閉 的反應(yīng)體系中進行，比較安全，易于處理。 常用的名詞概念 ? 本底信號（ Baseline） ? 熒光閾值（ Threshold） ? Ct值（ Ct value） ? 擴增曲線 前 15個循環(huán)熒光信號的均值，可手動調(diào)節(jié)選擇 默認是第 3～ 15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的 10倍，也可手動調(diào)節(jié) 擴增過程中，產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù) 常用的名詞概念 Threshold Baseline Ct value 熒光強度 Rn 擴增循環(huán)數(shù) 對數(shù)增長期 實際中的運用 左圖為 5個數(shù)量級的標準品擴增后得到的熒光曲線， 右圖以 Ct值為縱坐標， lgXs為橫坐標，可計算得出標準曲線 實時熒光定量 PCR的分類 ? 目前的實時熒光定量 PCR均是基于 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 （ Fluorescence resonance energy transfer， FRET）的原理。 F Q 10nm F Fluorophore,熒光基團 Q Quencher，淬滅基團 F Q 10nm 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ FRET）發(fā)生的條件 ? 熒光基團和淬滅基團都能發(fā)射熒光 ? 熒光基團的 發(fā)射光譜 和淬滅基團的 激發(fā)光譜 需有效重疊 ? 熒光基團和淬滅基團應(yīng)足夠的近（ 10nm） 波長 信 號 強 度 常見的實時熒光定量 PCR ? TaqMan探針法實時熒光定量 PCR ? 分子信標探針法實時熒光定量 PCR ? 雙鏈 DNA交聯(lián)熒光染料法實時熒光定量 PCR ? 雙雜交探針法實時熒光定量 PCR ? 蝎形探針法實時熒光定量 PCR 探針的熒光標記 ? 探針在其 5’端標記一個 熒光基團 ，如 6羧基熒光素 (FAM)、四氯 6羧基熒光素 (TET)、六氯 6羧基熒光素 (HEX)等 ? 探針在其 3’端標記一個 淬滅基團 ，如 6羧基 四甲基羅丹明 (TAMRA) TaqMan探針法實時熒光定量 PCR 引物
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