熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv-免費閱讀
【正文】 DNA提取液的作用 ? DNA提取液的主要成分： NP40 TritonX100 Chelex100 EDTA() TrisHCl (pH ) NaOH （乙基苯基聚乙二醇）很溫和的去垢劑， 1%濃度的基本可以破壞掉胞膜，而對核膜破壞的作用弱 （聚乙二醇辛基苯基醚 ）一種非離子性去垢劑，被用來做細(xì)胞破膜劑 /細(xì)胞通透劑 （聚苯乙烯二乙烯基苯）提取 DNA過程中，Chelex100能有效除去非核酸有機物 螯合 Mg、 Ca等二價金屬離子，抑制依賴金屬離子的脫氧核糖核酸酶對 DNA的降解作用 （三羥甲基氨基甲烷）與鹽酸按比例混合后形成的一種緩沖液體系， DNA在這一體系中呈穩(wěn)定態(tài) 核酸在 pH 5~9是穩(wěn)定的，pH12 /3會引起雙鏈之間氫鍵解離而變性 淋巴細(xì)胞分離液的作用 ? 人外周血中各種細(xì)胞的密度不同，紅細(xì)胞為，粒細(xì)胞為 ，淋巴細(xì)胞為177。 熒光定量 PCR在臨床的應(yīng)用 ? 常見的異常結(jié)果： 假陽性 、 假陰性 和 “ 灰區(qū) ” ? 如何發(fā)現(xiàn)異常結(jié)果： ① 設(shè)定 陽性對照 、 陽性質(zhì)控 （低值、中值、高值）和 陰性對照 ② 加入 內(nèi)標(biāo)試劑 與標(biāo)本一起擴(kuò)增，幫助判斷假陰性結(jié)果出現(xiàn) 熒光定量 PCR在臨床的應(yīng)用 ? 如何判斷： ? 標(biāo)本結(jié)果為陰性，而內(nèi)標(biāo)熒光不隨著擴(kuò)增而增加，則可判斷為假陰性結(jié)果 陽性對照 陰性對照 陽性低值 陽性中值 陽性高值 判斷結(jié)果 + 在控 在控 在控 結(jié)果可靠 + +/ 可能出現(xiàn)假 陽性 + + 陽性結(jié)果不 可靠 +/ 偏低 / 偏低 偏低 可能出現(xiàn)假 陰性 偏低 / 偏低 所有結(jié)果不 可靠 熒光定量 PCR在臨床的應(yīng)用 ? 出現(xiàn)異常結(jié)果的原因： ①試劑和實驗器材的原因：試劑過期失效，耗材中存在 DNase、 RNase、 抑制物等 ②實驗操作不當(dāng) ③ 標(biāo)本間污染 ：相臨的測試孔結(jié)果相近 ★ ④ 氣溶膠污染 ：大范圍的陽性結(jié)果 ⑤儀器故障 熒光定量 PCR在臨床的應(yīng)用 ? 有效防止和消除 氣溶膠 污染的方法： ①保持實驗室的通風(fēng)，最好有機械通風(fēng)設(shè)備 ② 10%次氯酸鈉溶液的噴灑和擦拭 ③ 1M HCl溶液的浸泡 ④紫外線的照射： 500bp片段敏感 ⑤ 75%或無水乙醇溶液噴霧 熒光定量 PCR在臨床的應(yīng)用 ? 在反應(yīng)體系中使用 dUTP和 UNG酶消除以往實驗的污染影響 UNG酶（尿嘧啶 N糖基化酶）：選擇性水解斷裂含有 dU的雙鏈和單鏈中的尿嘧啶糖苷鍵，在堿性介質(zhì)和高溫下會進(jìn)一步水解斷裂，酶的最佳活性溫度是 50℃ ，在 95 ℃ 失活。 與普通 PCR的比較 ? 普通 PCR完成后，才能進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，而且分析的過程可能產(chǎn)生一定的生物危害和環(huán)境污染 。 ? 而且 DNA的延伸是在 37℃ 完成，模板和引物容易錯配，造成反應(yīng)的 特異性很差 。 PCR的原理 ? 變性 ：雙鏈 DNA在高溫下解開成單鏈的過程 。溫度一般為 95℃ 左右。 T
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1