熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv-wenkub
2023-01-21 08:24:55 本頁面
【正文】 CR的原理 ? 退火 ：溫度下降后，兩條配對的單鏈 DNA重新結(jié)合為雙鏈的過程。 ? 如何做到： ①實(shí)習(xí)之前要復(fù)習(xí)理論知識和實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容 “ 理論先行 ” ②實(shí)習(xí)過程中要“ 聰明 ” ③做好實(shí)習(xí)筆記，用心思考， 實(shí)習(xí)之外下功夫 如何做一個(gè)“聰明”的實(shí)習(xí)生 聰 明 耳：認(rèn)真聽老師的說明和講解 看：仔細(xì)看老師的操作 問：有疑問要多提問，多討論 心：要用心去思考 日月：要每天每月堅(jiān)持做到 內(nèi)容概要 ? PCR的定義和原理 ?熒光定量 PCR的原理和分類 ?熒光定量 PCR結(jié)果的分析 ?熒光定量 PCR在臨床的應(yīng)用 PCR的定義 ? PCR是 Polymerase Chain Reaction的縮寫，中文稱為 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ，由 變性 、 退火 及 延伸 幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期 ,循環(huán)進(jìn)行 ,可使目的 DNA得以迅速擴(kuò)增。 ? 由美國 PE公司遺傳部的 Dr. Mullis發(fā)明，由于PCR技術(shù)的跨時(shí)代意義， Mullis獲得了 1993年諾貝爾化學(xué)獎。溫度一般為 50~60℃ 。 ? Klenow酶不耐高溫， 90℃ 加熱后會 變性失活 ，每次循環(huán)結(jié)束都要加入新鮮的酶。 ? 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)于 1996年由美國 Applied Biosystems， ABI公司 推出，實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍。 ? 熒光定量 PCR通過監(jiān)測熒光值的變化，體現(xiàn)每一個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，分析結(jié)果為 定量 結(jié)果。 F Q 10nm F Fluorophore,熒光基團(tuán) Q Quencher，淬滅基團(tuán) F Q 10nm 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ FRET）發(fā)生的條件 ? 熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)都能發(fā)射熒光 ? 熒光基團(tuán)的 發(fā)射光譜 和淬滅基團(tuán)的 激發(fā)光譜 需有效重疊 ? 熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)應(yīng)足夠的近（ 10nm） 波長 信 號 強(qiáng) 度 常見的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR ? TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR ? 分子信標(biāo)探針法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR ? 雙鏈 DNA交聯(lián)熒光染料法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR ? 雙雜交探針法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR ? 蝎形探針法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 探針的熒光標(biāo)記 ? 探針在其 5’端標(biāo)記一個(gè) 熒光基團(tuán) ，如 6羧基熒光素 (FAM)、四氯 6羧基熒光素 (TET)、六氯 6羧基熒光素 (HEX)等 ? 探針在其 3’端標(biāo)記一個(gè) 淬滅基團(tuán) ，如 6羧基 四甲基羅丹明 (TAMRA) TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物延伸所用到的DNA聚合酶 Taq酶同時(shí)具有 5’→ 3’方向核酸聚合酶活性 ，還具有對聚合延伸中遇到與靶序列結(jié)合的核苷酸序列的 5’→ 3’核酸 外切酶活性 。 ? TaqMan法 特異性高 ， 重復(fù)性好 ， 價(jià)格適中 ，可以滿足臨床上檢測特定項(xiàng)目的要求。 人巨細(xì)胞病毒 DNA檢測試劑盒 ? 巨細(xì)胞病毒 DNA的提取（血清或血漿） 100μl血清 或血漿 100μl DNA濃縮液 去除上清液，保留沉淀 12022rpm，10min 人巨細(xì)胞病毒 DNA檢測試劑盒 巨細(xì)胞病毒 DNA的提?。ㄑ寤蜓獫{） 加入50μl DNA提取液 劇烈振蕩混勻 510s 100℃加熱10min 人巨細(xì)胞病毒 DNA檢測試劑盒 ? 巨細(xì)胞病毒 DNA的提?。ㄑ寤蜓獫{） 4℃ 放置或用于 PCR 振蕩混勻5~10s 12022rpm，
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