【正文】 ，特異性高，退火后探針與目的基因互補(bǔ)序列結(jié)合，隨著與目的基因互補(bǔ)序列結(jié)合，隨著 PCR反應(yīng)的進(jìn)行，在反應(yīng)的進(jìn)行，在 Taq酶酶 5’3’外切酶的作用下，探針?biāo)鈹嗔?，熒光產(chǎn)生。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR常用的三個概念常用的三個概念（（ 3）、）、 CT值值 PCR過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時，所經(jīng)過的過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時，所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。DNA聚合酶聚合酶催化下，在體外用核苷酸（催化下，在體外用核苷酸（dNTP）大量合成目的基因或）大量合成目的基因或DNA片段。Reaction以目的基因或以目的基因或 DNA片段為模板片段為模板，在引物介導(dǎo)及，在引物介導(dǎo)及 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR技術(shù)概論技術(shù)概論 熒光定量熒光定量 PCR技術(shù)產(chǎn)生并成熟于上世紀(jì)技術(shù)產(chǎn)生并成熟于上世紀(jì) 90年代，由于該技年代，由于該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，能夠?qū)亩ㄐ缘蕉康娘w躍，能夠?qū)?PCR反應(yīng)的全過程反應(yīng)的全過程進(jìn)進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，并且自動化程度高，所以該技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在短行實(shí)時監(jiān)控，并且自動化程度高，所以該技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在短短的十幾年時間，在科研及檢驗(yàn)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用短的十幾年時間，在科研及檢驗(yàn)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用 ， 成為成為分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。 系統(tǒng)組成：定量系統(tǒng)組成：定量 PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。所有樣品的熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度的差值全部相同。理想的熒光物質(zhì)需具備以下特反應(yīng)進(jìn)程的。淬滅基團(tuán)：淬滅基團(tuán)： TAMRA、 BHQ、 ECLIPSE等。 BHQ和和 ECLIPSE為非熒光物質(zhì)，只是一種熒光淬滅劑，本身不會為非熒光物質(zhì)，只是一種熒光淬滅劑，本身不會 產(chǎn)生熒光，光吸收范圍較寬，因此本底較低，作為淬滅基團(tuán)較產(chǎn)生熒光，光吸收范圍較寬，因此本底較低，作為淬滅基團(tuán)較 為常用，尤其在多重?zé)晒舛繛槌Ｓ?，尤其在多重?zé)晒舛?PCR時常常被采用。（（ 2）、對引物及試劑要求不高，配套的普通引物就可以使）、對引物及試劑要求不高，配套的普通引物就可以使 用，普通的用，普通的 Taq酶就能滿足實(shí)驗(yàn)的要求。（（ 4）、目前價格也不是太貴，）、目前價格也不是太貴， 2OD 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)（（ 2）、熒光染料類）、熒光染料類 目前常用的熒光染料為目前常用的熒光染料為 SYBR GreenⅠⅠ 、 SYBR GreenⅡⅡ 、 SYTO HRM等。（（ 6）、對）、對 PCR反應(yīng)的毒性，能抑制反應(yīng)的毒性，能抑制 PCR反應(yīng)，降低反應(yīng)，降低 PCR反應(yīng)的效率。對數(shù)全部一致，都達(dá)到了閾值。直接關(guān)系。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 使用熒光染料作為熒光基團(tuán)時，由于熒光染料的特性隨著使用熒光染料作為熒光基團(tuán)時，由于熒光染料的特性隨著 PCR反應(yīng)的進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，雙鏈行，雙鏈 PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，產(chǎn)物呈指數(shù)增長， SYBR GreenⅠⅠ 與雙鏈與雙鏈 PCR產(chǎn)物結(jié)合后熒光越產(chǎn)物結(jié)合后熒光越來越強(qiáng)，當(dāng)來越強(qiáng)，當(dāng) PCR反應(yīng)結(jié)束時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，此時對反應(yīng)結(jié)束時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，此時對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行緩慢產(chǎn)物進(jìn)行緩慢加熱，從加熱，從 50℃℃ 一直加熱到一直加熱到 99℃℃ ，在此過程中，在此過程中 PCR產(chǎn)物按照產(chǎn)物按照 TM值的大小雙鏈值的大小雙鏈被被依次打開，熒光強(qiáng)度也隨著雙鏈的打開依次減弱，如下圖：依次打開，熒光強(qiáng)度也隨著雙鏈的打開依次減弱，如下圖：一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 對于核酸序列相同的對于核酸序列相同的 PCR產(chǎn)物，其產(chǎn)物，其 TM值也相同，而且其值也相同，而且其 TM值在一個很小值在一個很小的溫度范圍內(nèi)，在此溫度區(qū)間，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光強(qiáng)的溫度范圍內(nèi)，在此溫度區(qū)間，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光強(qiáng)度急劇降低，以熒光強(qiáng)度的變化率和溫度來作圖，則可得到如下圖：度急劇降低，以熒光強(qiáng)度的變化率和溫度來作圖，則可得到如下圖： 一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 上圖就是熔解曲線，熔解曲線反映的是一定序列長度的核上圖就是熔解曲線，熔解曲線反映的是一定序列長度的核酸雙鏈，在一定的離子強(qiáng)度下的酸雙鏈，在一定的離子強(qiáng)度下的 TM值。 電泳是通過核酸分子量的大小和構(gòu)象來分析的，熔解曲線電泳是通過核酸分子量的大小和構(gòu)象來分析的，熔解曲線是根據(jù)雙鏈核酸的是根據(jù)雙鏈核酸的 TM值來分析的，這與瓊脂糖電泳及值來分析的，這與瓊脂糖電泳及 SSCP有有異異曲同工之處。 實(shí)驗(yàn)操作中，由于樣品選取時樣品的細(xì)胞個數(shù)不可能完全相同，實(shí)驗(yàn)操作中，由于樣品選取時樣品的細(xì)胞個數(shù)不可能完全相同， RNA提取提取時得率不同、時得率不同、 RNA反轉(zhuǎn)錄為反轉(zhuǎn)錄為 cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會用一些看內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成究中都會用一些看內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論 mRNA差異表達(dá)的相對定量分析差異表達(dá)的相對定量分析以上公式就是引入內(nèi)參基因后相對定量分析的基本公式，并由此派生出兩以上公式就是引入內(nèi)參基因后相對定量分析的基本公式，并由此派生出兩種相對定量的分析方法種相對定量的分析方法 ：： 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和 Deltadelta Ct法。 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的特點(diǎn)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的特點(diǎn) ：： （（ a）、考慮到了不同基因擴(kuò)增效率的差異，用標(biāo)準(zhǔn)曲線來校正擴(kuò)增效）、考慮到了不同基因擴(kuò)增效率的差異，用標(biāo)準(zhǔn)曲線來校正擴(kuò)增效 率，最大限度的避免了誤差；率，最大限度的避免了誤差； （（ b）、思路直觀、條理清晰、應(yīng)用簡便，操作靈活，無需像）、思路直觀、條理清晰、應(yīng)用簡便，操作靈活，無需像 Delta delta CT法那樣對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行反復(fù)的優(yōu)化；法那樣對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行反復(fù)的優(yōu)化； （（ c）、其不足之處是每次實(shí)驗(yàn)都必需對目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲）、其不足之處是每次實(shí)驗(yàn)都必需對目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲 線；線； （（ d）、該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實(shí)驗(yàn)。 該方法要求嚴(yán)格的重復(fù)，因?yàn)?CT值的差異只要有很小的變化，測得的結(jié)果就會有很大的差別。 在在 Taqman探針及引物的設(shè)計過程中，引物的探針及引物的設(shè)計過程中，引物的 TM值已經(jīng)確定為值已經(jīng)確定為 60℃℃ 左左右，在每輪右，在每輪 PCR循環(huán)的復(fù)性過程中（循環(huán)的復(fù)性過程中（ 95→→ 60℃℃ ），為了確保探針先于引物），為了確保探針先于引物與與模板結(jié)合，這就要求探針的模板結(jié)合，這就要求探針的 TM值高于引物值高于引物 10℃℃ 左右，所以左右，所以 Taqman探針及探針及引引物一般都是引物物一般都是引物 TM值為值為 60℃℃ 左右，探針的左右，探針的 TM值為值為 70℃℃ 左右。二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計探針的設(shè)計 Taqman探針及引物合成時注意事項(xiàng)探針及引物合成時注意事項(xiàng)（（ 1）、引物及探針設(shè)計好之后，委托一家放心的合成公司合成；）、引物及探針設(shè)計好之后，委托一家放心的合成公司合成；（（ 2）、先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通）、先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，電泳檢測，電泳檢測 PCR產(chǎn)物，看是否和設(shè)計的長度吻合，再看看非特異產(chǎn)物，看是否和設(shè)計的長度吻合，再看看非特異 性擴(kuò)增情況，必要時進(jìn)行性擴(kuò)增情況，必要時進(jìn)行 PCR產(chǎn)物的測序驗(yàn)證；產(chǎn)物的測序驗(yàn)證；（（ 3）、確定引物沒有問題后，再將探針?biāo)徒缓铣桑@樣安排能避免很多以）、確定引物沒有問題后，再將探針?biāo)徒缓铣?，這樣安排能避免很多以 外的損失；外的損失；（（ 4）、探針合成好后，先檢測一下探針的質(zhì)量，）、探針合成好后，先檢測一下探針的質(zhì)量， 250nm的探針終濃度，的探針終濃度， 25ul水，反應(yīng)體系中只有水和探針，在熒光定量水，反應(yīng)體系中只有水和探針，在熒光定量 PCR儀上檢測，儀上檢測， 95℃℃ ， 2min。影響。一方面可能引致錯誤甚至相反的結(jié)論。的表達(dá)水平也不同。表達(dá)量顯著上調(diào)。內(nèi)參分析軟件來選擇合適的內(nèi)參基因。的反應(yīng)效率。四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化如何優(yōu)化、如何優(yōu)化SYBR GreenⅠⅠ 反應(yīng)體系中反應(yīng)體系中 Mg2＋濃度梯度優(yōu)化＋濃度梯度優(yōu)化 PCR電泳結(jié)果電泳結(jié)果四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化如何優(yōu)化、如何優(yōu)化優(yōu)化后的 Taqman探針體系實(shí)驗(yàn)結(jié)果， Mg2＋濃度為＋濃度為，引物濃度為左右，引物濃度為 500nM，探針濃度為，探針濃度為 250nM。倍的變化）。因種類相對較多的實(shí)驗(yàn)。雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法誤差相對較小。要想達(dá)到這個目實(shí)驗(yàn)，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯誤。如測定一種藥物處理樣品時，必須確保樣品都得到了充分的處理。所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達(dá)恒定基因作為內(nèi)參。參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。檢測出來。前了，由熔解曲線可知對于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。有可能引起污染。產(chǎn)物污染的有效辦法，但是成本較高。此類污染。假如這個污染屬于是頑固的未知污染，可以用正常樣品測得的初始模板量減去 227，來避免污染引起的誤差八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將得到的結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)在很多軟件都帶有結(jié)果的自動分實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將得到的結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)在很多軟件都帶有結(jié)果的自動分析功能，可以將結(jié)果直接轉(zhuǎn)化為各種圖表及柱狀圖。謝 謝！電話： 15238020968， ： 458261751，都市巡洋艦如有問題需要交流，請隨時聯(lián)系 ！