熒光定量pcrppt課件-文庫吧資料
2025-01-23 18:46本頁面
【正文】 團發(fā)出熒光 在延伸過程中，探針部分與靶序列分離 熒光信號強度與結(jié)合探針的 DNA分子成正比。 ? SYBR Green I只與雙鏈 DNA結(jié)合才能發(fā)出熒光。 成熟 miRNA qPCR檢測 – 莖環(huán)法 優(yōu)點：特異引物逆轉(zhuǎn)錄，理論上效率更高，檢測更靈敏 缺點：莖環(huán)引物設(shè)計復(fù)雜；特異引物逆轉(zhuǎn)錄不便多基因檢測 檢測方法選擇 ? 依樣本特性，檢測目標(biāo)多寡而定 ? 康為技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗舉例： – 復(fù)旦大學(xué)某客戶 ? miRNA芯片提示 10個 miRNA在病人與正常人之間有顯著差異表達 ? 要求從 66個外周血 RNA樣本中檢測這 10個 miRNA ? 加尾法 ， 5個目標(biāo)獲得良好檢測 ? 莖環(huán)法， 4個目標(biāo)獲得良好檢測 ? 1個目標(biāo)的檢測很難，嘗試多種引物設(shè)計，調(diào)整反應(yīng)體系 康為 miRNA產(chǎn)品 小 RNA提取試劑盒 加尾法 miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒 miRNA熒光定量 PCR檢測試劑盒 CW0627 CW2141 CW2142 康為 miRNA檢測服務(wù) 全套 miRNA檢測：從生物樣本到數(shù)據(jù) 莖環(huán)法 miRNA檢測引物：定制 (Real time Quantitative PCR) ?miRNA的特點及檢測 ?熒光定量 PCR檢測 內(nèi) 容 PCR： 偉大的天才發(fā)明 ? Use of LSD ? Synthesis and selftesting of novel psychoactive substances ? Belief in astrology PCR：理想與現(xiàn)實 起點定量 終點定量 ? 起點定量檢測 ： 起點量是樣本中未經(jīng) PCR放大 之前的模板量 具有重現(xiàn)性，誤差小 “加入了 500個拷貝 ” ? 終點定量檢測 ： 終點產(chǎn)物量經(jīng)過 PCR放大的 DNA量 不恒定，誤差大 “生成了 500， 0000， 0000個拷貝 ” 擴增曲線 Ct值： ?模板 DNA量越多， 熒光強度達到檢測域值所需的循環(huán)數(shù) 越少， 即 Ct值越小。 Specific miRNA quantification by real time PCR – way to go 關(guān)鍵難點 ? 豐度低 – 解決辦法 :小 RNA提取 ? 太短 – 解決辦法 : 加長 ? 序列高度相似 miRNA之間難以區(qū)分 – 解決辦法 : 特殊設(shè)計的檢測方法；小心設(shè)計引物與反應(yīng)優(yōu)化 解決 miRNA豐度難題 基本原理 影響 RNA分子與硅膠柱結(jié)合的因素 ? 離液劑 chaotropic agent，如鹽酸胍 ? 離子強度，如 NaCl ? 小分子有機溶劑，如乙醇 精心調(diào)整各組份配比，達成大、小 RNA與 硅膠柱結(jié)合的區(qū)分條件，分離去除大分子量 RNA，富集小分子量 RNA 小 RNA提取 M 1 2 3 M： Marker 1：康為柱式分離的小片段 RNA 2：康為柱式分離的
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