【正文】 A進(jìn)行定量 A A pBluescriptII SK(+)vector 生物秀 — 專心做生物！ 絕對(duì)定量應(yīng)用例 對(duì) SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量 體外轉(zhuǎn)錄的 Internal control RNA電泳照片 M1: ? Hind Ⅲ digest M2: DL2022 Marker 純化的 SARS Internal Control RNA OD值測(cè)定結(jié)果 M1 M2 DNase I 處理前 DNase I 處理后 生物秀 — 專心做生物！ 探針的選擇 絕對(duì)定量應(yīng)用例 對(duì) SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量 Template Primer Taq Man Probe 5’端報(bào)告基團(tuán) 3’端淬滅基團(tuán) SARS Control RNA or SARS Genome RNA 共用 FAM標(biāo)記 Eclipse標(biāo)記 SARS Internal Control RNA 共用 ROX標(biāo)記 Eclipse標(biāo)記 生物秀 — 專心做生物！ SARS Control RNA105101擴(kuò)增曲線 SARS genome RNA Sample ２、３擴(kuò)增曲線 SARS Internal control RNA擴(kuò)增曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線 絕對(duì)定量應(yīng)用例 對(duì) SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量 生物秀 — 專心做生物！ 定量結(jié)果 絕對(duì)定量應(yīng)用例 對(duì) SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量 對(duì)三個(gè)樣品所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行了準(zhǔn)確定量。 相對(duì)表達(dá)量計(jì)算 相對(duì)值 = 校正值 = 目的基因定量結(jié)果 管家基因定量結(jié)果 檢測(cè)樣品的校正值 對(duì)照樣品的校正值 相對(duì)定量解析順序 檢測(cè)樣品 管家基因 H 目的基因 X 定量結(jié)果 定量結(jié)果 校正值 相對(duì)量 RNA樣品 1 RNA樣品 2 RNA樣品 3 543210123相對(duì)表達(dá)量（Log2）R N A 樣品1 R N A 樣品2 R N A 樣品3R N A 樣品1R N A 樣品2R N A 樣品3生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識(shí) Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 應(yīng)用實(shí)例 Real Time PCR 相關(guān)試劑與服務(wù) 主要內(nèi)容 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 應(yīng)用實(shí)例 定性分析 對(duì)人的 ALDH2基因進(jìn)行 SNP解析 絕對(duì)定量 對(duì) SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量分析 相對(duì)定量 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化 生物秀 — 專心做生物！ 定性分析應(yīng)用例 對(duì)人的 ALDH2基因進(jìn)行 SNP解析 檢測(cè)方法 Cycling Probe法 SNP位點(diǎn) ALDH2 type1和 ALDH2 type2 (G/A) 使用試劑 Cycleave PCR Core Kit TaKaRa 使用儀器 Smart Cycler Ⅱ 實(shí)驗(yàn)背景 Aldehyde dehydrogenase2（ ALDH2） 基因位于人類第 12對(duì)染色體 q24位置 ， 有 ALDH2 type1和 ALDH2 type2兩種基因型 ， 其基因表現(xiàn)序列最主要的差別在 exon12第 487個(gè)氨基酸位置 ，ALDH2 type1型為 Glu(GAA), ALDH2 type2型為 Lys(AAA)。 105 104 103 101 擴(kuò)增曲線圖 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 檢測(cè)樣品 檢測(cè)樣品 102 以上條件不可能同時(shí)得到滿足，必須用內(nèi)對(duì)照基因（管家基因）校正， 進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。 生物秀 — 專心做生物！ 特異性產(chǎn)物 非特異產(chǎn)物 引物二聚體 對(duì) PCR產(chǎn)物特異性進(jìn)行分析 融解曲線分析 生物秀 — 專心做生物！ 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 融解曲線分析 絕對(duì)定量和相對(duì)定量解析方法 Real Time PCR 解析方法 生物秀 — 專心做生物！ 提取樣品 絕對(duì)定量解析方法 引物設(shè)計(jì) 標(biāo)準(zhǔn)品制備 Real Time PCR反應(yīng) 數(shù)據(jù)分析 流 程 生物秀 — 專心做生物！ 絕對(duì)定量解析方法 通過(guò)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定樣品的初始模板拷貝數(shù)或濃度。 相關(guān)系數(shù) 斜率 擴(kuò)增效率（ E）計(jì)算方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線 X軸表示起始模板濃度（ log10)， Y軸表示 Ct值時(shí) E=101/a1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 X軸表示 Ct值， Y軸表示起始模板濃度（ log10) E=10a1 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 解析方法 ? 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 ? 融解曲線分析 ? 絕對(duì)定量和相對(duì)定量解析方法 生物秀 — 專心做生物！ Tm值是指雙鏈 DNA分子解鏈一半時(shí)的溫度。 體外轉(zhuǎn)錄 RNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程 T7 RNA polymerase 體外轉(zhuǎn)錄 RNA Total RNA PCR cDNA RT T7 Promoter TTTT???T PCR產(chǎn)物 目的基因 目的基因 目的基因 AAAA???A AAAA???A 生物秀 — 專心做生物！ 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 擴(kuò)增曲線 106 105 104 103 102 101 標(biāo)準(zhǔn)曲線 106 105 104 103 102 101 ? 標(biāo)準(zhǔn)品梯度的選擇： 5～ 6個(gè)梯度 ? 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)的選擇： 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)通常為 10 生物秀 — 專心做生物！ 理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線 相關(guān)系數(shù)（ r2）：大于 ，越接近 1，結(jié)果可信度越高。 目的基因 目的基因 目的基因 質(zhì)粒 生物秀 — 專心做生物！ …… …… 綠色 部分為 Real Time引物區(qū) 紅色 部分為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建用引物區(qū) 藍(lán)色 部分 T7啟動(dòng)子和 Poly(T) RNA標(biāo)準(zhǔn)品引物設(shè)計(jì) 生物秀 — 專心做生物！ RNA純化后，測(cè) OD定量。 cDNA 體外轉(zhuǎn)錄 RNA PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒 生物秀 — 專心做生物！ 綠色 部分為 Real Time引物區(qū) 紅色 部分為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建用引物區(qū) 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品引物設(shè)計(jì) 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 AGTACCTAGATCCTAG AGTACCTAGATCCTAG 生物秀 — 專心做生物！ 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程 基因組 DNA PCR 目的基因克隆 質(zhì)粒提取， OD值定量。RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)提供無(wú)重復(fù)，準(zhǔn)確性，完整性的基因參考序列。 目的是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。 5’ 3’ Gene specific Primer 目的片段 R F AAA 目的片段在距 Poly(A) Tail 。 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) ? One Step RTPCR和 Two Step RTPCR的選擇 ? RT Primer的選擇 ? Total RNA中 genomic DNA混入的對(duì)策 Real Time PCR反應(yīng) ? Real Time PCR引物及探針的設(shè)計(jì) ? 引物反應(yīng)性確認(rèn) ? PCR條件優(yōu)化順序 生物秀 — 專心做生物！ One Step RTPCR 和 Two Step RTPCR的選擇 Two Step RTPCR One Step RTPCR cDNA分裝 適用于 mRNA表達(dá)量解析 ? Two Step RTPCR效率高 ? 使用 Random和 OligodT 引物可以制備 cDNA pool ? cDNA可長(zhǎng)期保存 適用于病毒、病原菌檢測(cè) ? 操作簡(jiǎn)單 ? 污染幾率低 生物秀 — 專心做生物！ Random 6mer Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer RT Primer的選擇 Random 6mer Primer Gene specific Primer Oligo dT Primer 生物秀 — 專心做生物！ RT Primer的選擇 Random 6mer 1,500base 目的片段 5’ 3’ R F 目的片段在 mRNA任何位置都能使用。 96 無(wú) 4 慢 8聯(lián)管 或單管 有 Mx3005PTM 5 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識(shí) Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 應(yīng)用實(shí)例 Real Time PCR 相關(guān)試劑與服務(wù) 主要內(nèi)容 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 Real Time RTPCR反應(yīng) ? 以 RNA為起始實(shí)驗(yàn)材料時(shí)。 、 Mx3005PTM 杭州博日 LINEGENE FQD33A、 LINEGENE FQD66A Real Time PCR檢測(cè)系統(tǒng) 簡(jiǎn)介 LightCycler174。 TD BioRad公司 iCycler iQ、 iQ5 RealTime PCR Detection System Corbett Research公司 Rotorgene202 Rotorgene3000 、 Rotorgene6000 MJ Research公司 Opticon、 MJ Mini Cycler、 MiniOpticon Stratagene公司 Mx4000174。 、 LightCycler174。 TaKaRa公司可以提供 最佳引物的設(shè)計(jì)合成服務(wù) Real Time 進(jìn)入 SYBR Green I 時(shí)代 保證以上條件，使用 SYBR Green I將 會(huì)更加便宜，更為方便，并擁有良 好的特異性。 ● Primer Dimer的產(chǎn)生 二條引物的 3’端具有互補(bǔ)序列時(shí)，引物自身也會(huì)進(jìn)行擴(kuò)增， 產(chǎn)生短鏈 DNA片段（ Primer Dimer）。 以前對(duì) PCR引物的選擇、 PCR試劑的優(yōu)化 經(jīng)驗(yàn)不足， Probe法較為廣用。 Probe法 ◆優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，能進(jìn)行多重 PCR。 Q R 核糖核苷酸 Cycling Probe法 生物秀 — 專心做生物！ 熱變性 酶切 延伸 Cycling Probe法基本原理 退火 SYBR Green I法 vs Probe法 SYBR Green I 法 ◆優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格便宜、使用方便、 無(wú)需合成特異性探針。 熒光染料嵌合法 (SYBR Green I) SYBR Green I 生物秀 — 專心做生物！ 熒光染料嵌合法 (SYBR Green I)作用機(jī)理示意圖 熱變性 引物退火 延伸反應(yīng) 生物秀 — 專心做生物！ TaqMan探針為一寡核苷酸， 5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán) (Reporter)， 3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅熒光基團(tuán) (Quencher)。 Real Time PCR 原理 生物秀 — 專心做生物！ 在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)積累的整個(gè) PCR進(jìn)程，最后通過(guò)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知濃度的樣品進(jìn)行定量分析。 Real Time PCR 生物秀 — 專心做生