熒光定量pcrppt課件-wenkub.com
2025-01-14 18:46 本頁面
【正文】 模板濃度進(jìn)行 10倍稀釋，稀釋 6個(gè)梯度。 4. 嘗試不同熱循程序，降低復(fù)性溫度。 誤差控制 ? 使用 Master mix ? 配置預(yù)混體系 ? 設(shè)置生物學(xué)重復(fù) （不同個(gè)體） 技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔） ? 陰性對照 熒光定量 PCR體系 2ΔΔ Ct法 滿足條件： 1）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率接近 正負(fù) 10% 2）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率基本為 90%110% 相對定量數(shù)據(jù)分析 目標(biāo)基因的 CT值 內(nèi)參基因的 CT值 待測樣本的 ΔCT 值 對照樣本的 ΔCT 值 計(jì)算表達(dá)水平比率： 2 –ΔΔCT =表達(dá)量的比值 2△△ Ct 法 目的 基因 內(nèi)參 基因 目的基因 內(nèi)參基因 △ Ct 待測樣本 對照樣本 △△ Ct 倍數(shù)值 fold 2△△ Ct 對照樣本 0 1 待測樣本 Trouble shooting 常見問題 可能原因 解決方法 Housekeeping gene 無信號 RNA降解 用新鮮組織提取 RNA Housekeeping gene 有信號 而目標(biāo)基因無信號 1. 目的基因表達(dá)低。每次只能做一個(gè)基因。 Housekeeping Gene 康為產(chǎn)品 ?不同豐度： 高豐度 ACTB、 GAPDH 中等豐度 beta2M 低豐度 HPRT1 ?不同物種： 人、大鼠、小鼠、豬、牛、羊、雞、斑馬魚、甘蔗 等 基因表達(dá)分析檢測 ? 樣本處理與 RNA提取 – cDNA – qPCR ? 內(nèi)參基因 (housekeeping gene)選擇 樣本處理與 RNA提取 ? 外界刺激 – 10分鐘 – 可檢測的表達(dá)改變 ? 樣品離開定義環(huán)境 – 2分鐘內(nèi) –固定、裂解細(xì)胞 – RNA樣本保存液 – Trizol – 超純 RNA提取試劑盒 ? RNA的評價(jià)與鑒定 完整性 純度 ? 小心 DNA污染！ 使用 DNaseⅠ 引物設(shè)計(jì) 以 RNA作 PCR陰性對照 CW0580 CW0592 CW0581 CW2090A RTqPCR一步法還是兩步法？ 兩步法： 步驟多但靈活多樣。 染料法與探針法 對比 探針法 ? 特異性高 與探針與特異靶序列結(jié)合 ? 對模板有選擇性 可進(jìn)行多重 PCR反應(yīng) ? 成本高 不同靶基因需要合成不同探針 染料法 ? 通用性好 對 DNA模板沒有選擇性 ? 使用方便，成本低 僅需設(shè)計(jì)兩個(gè)引物 ? 有假陽性現(xiàn)象 通過融解曲線
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