熒光定量pcrppt課件(參考版)
2025-01-20 18:46本頁面
【正文】 康為世紀(jì)產(chǎn)品 RNA Trizol 超純 RNA提取試劑盒 動(dòng)物組織 RNA 植物 RNA 血液 RNA 病毒 RNA 逆轉(zhuǎn)錄 SuperRT / HiFiMMLV逆轉(zhuǎn)錄酶 cDNA第一鏈合成試劑盒 RTPCR 一步法、兩步法試劑盒 熒光定量 PCR UltraSYBR Mixture FastSYBR Mixture GoldStar Taqman Mixture PCR GoldStar DNA Polymerase Taq /Es Taq DNA Polymerase Taq /Es Taq Master Mix 。 熒光定量產(chǎn)品 染料法 FastSYBR Mixture UltraSYBR Mixture ?GoldStar Taq ?特異性強(qiáng) ?靈敏度高 ?Ct值更低 ?線性范圍更廣 ?定量更準(zhǔn)確 ?反應(yīng)速度快 ?比普通反應(yīng)可節(jié)省約 40分鐘 ?適合于普通和快速定量 PCR程序 熒光定量產(chǎn)品 染料法 某其它品牌 康為 UltraSYBR cDNA用內(nèi)參 actin引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物片段 100bp。 Housekeeping gene 反應(yīng)效率正常 ,但 目標(biāo)基因放大效率不高 PCR引物不良 重新設(shè)計(jì)引物，減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo)區(qū)段， 考慮不同剪接體 目標(biāo)基因表達(dá)豐度在 樣本之間異常一致 RNA被基因組 DNA污染 intron 引物 DNase處理 RNA RNA陰性對(duì)照表現(xiàn)陰性 溶解曲線出現(xiàn)雜峰 PCR產(chǎn)物 PCR引物 ，升高復(fù)性溫度 ，將檢測溫度設(shè)定在在引物二聚體解鏈溫度與 PCR特異產(chǎn)物解鏈溫度之間。減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo) 區(qū)段，考慮不同剪接體。 逆轉(zhuǎn)錄效率不高 2. PCR引物不良 1. 富集 mRNA 2. 在逆轉(zhuǎn)錄中嘗試不同引物，如特異引物。 ? 需參照儀器要求選擇。 推薦：工作的成熟階段，以及多個(gè)樣本單個(gè)靶基因檢測。 一步法： 簡單、靈敏度高，有效減少實(shí)驗(yàn)操作誤差和污染。 cDNA可長期保留，檢測多個(gè)基因，便于反應(yīng)條件的優(yōu)化。 不同環(huán)境，不同器官、組織、細(xì)胞類型之間，表達(dá)量相對(duì)恒定。 數(shù)據(jù)分析 qPCR cDNA total RNA 內(nèi)參基因的選擇 特點(diǎn) 選擇內(nèi)參基因 內(nèi)參基因 betaactin、 GAPDH、 18S rRNA、 28S rRNA等 文獻(xiàn)檢索 實(shí)驗(yàn)篩選 選擇多個(gè)備選內(nèi)參基因，以備選內(nèi)參基因的幾何平均數(shù)作為均一化標(biāo)準(zhǔn) 內(nèi)參基因Housekeeping Gene RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄為 cDNA的效率不同，用于定量分析的樣本初始濃度不同。 SYBR Green I 工作原理 Taqman 工作原理 在退火過程中，探針與靶序列結(jié)合 探針被 Taq酶的 5’ 3’ 外切酶活性剪切成片斷 游離報(bào)告基
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