熒光定量pcr(參考版)
2024-08-12 14:01本頁面
【正文】 謝謝！ 。根據(jù)TaqMan 探針法在擴(kuò)增之前處理 DNA， 然后用特異的引物和探針可以區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA。 （ 4）、醫(yī)學(xué)及藥物開發(fā)中的檢測(cè)應(yīng)用 熒光定量 PCR 技術(shù)廣泛的應(yīng)用于臨床及其藥物方面，目前已經(jīng)在腫瘤研究，乙肝診斷，病毒檢測(cè)，動(dòng)物疾病檢測(cè)與防御，藥物療效的評(píng)價(jià)與考核等方面，為臨床理論研究、治療疾病和藥物開發(fā)提供了客觀的物質(zhì)基礎(chǔ)。 （ 3）、食品安全中的檢測(cè)應(yīng)用 人們?cè)谌粘Ｉ钪惺称肥欠癜踩?，進(jìn)出口食品和糧食是否含有危險(xiǎn)或潛在危險(xiǎn)的成分，都可以用熒光定量 PCR 技術(shù)進(jìn)行快速檢測(cè) ,熒光定量 PCR 方法是國(guó)內(nèi)外進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分含量檢測(cè)的常用方法。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確定量測(cè)出 （ 2）、基因表達(dá)研究的檢測(cè)應(yīng)用 熒光定量 PCR 技術(shù)對(duì) mRNA 水平的檢測(cè)比Northern 雜交、 RTPCR 等定量方法要方便、快速、準(zhǔn)確得多。 D、整條探針中，堿基 C的含量要明顯高于 G的含量。 B、探針長(zhǎng)度通常在 20－ 30bp， Tm值在 65－ 70℃ ，通常比引物高 5－ 10℃ ， GC含量在40%－ 70%。 F、為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子。 D、引物長(zhǎng)度通常在 20－ 25bp， Tm值在 55－ 65℃ ，GC含量在 40%－ 60%，產(chǎn)物大小在 100250bp之間。 B、引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾 結(jié)構(gòu)。 （ 5）、速度快、高通量，可在 2－ 3小時(shí)完成 96個(gè)樣品的定量分析。 （ 4）、操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高、防污染。 （ 2）、靈敏度高，熒光 PCR檢測(cè)技術(shù)是綜合了 PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯象技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測(cè)靈敏度很高。 八、 熒光定量 PCR的優(yōu)點(diǎn) （ 1）、特異性好，使用特異性探針對(duì)定量分子進(jìn)行識(shí)別，具有很高的準(zhǔn)確性。同一個(gè)模板在 96孔 PCR儀上做 96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異（如下圖所示），因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量；雖然加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。為了保證線性，研究者要擴(kuò)增一系列梯度稀釋的 cDNA或者對(duì)每個(gè)基因的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整；有的研究者加一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性模板，有的做限制性的稀釋梯度分析，或者加一個(gè) PCR模擬（ mimic）反應(yīng)，即用相似的引物與目標(biāo)產(chǎn)物共擴(kuò)增，而擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)通常在跑膠以后通過染料、放射活性或者探針進(jìn)行檢測(cè)。 FRET工作原理 幾種探針的比較： 七、傳統(tǒng)的定量 PCR的難點(diǎn) （ 1）如何確定 PCR正處于線性擴(kuò)增范圍內(nèi)（只有在此范圍內(nèi) PCR產(chǎn)物信號(hào)才與初始模板的拷貝數(shù)成比例）。由于 FRET探針是靠近發(fā)光，所以檢測(cè)信號(hào)是實(shí)時(shí)信號(hào)，非累積信號(hào)。當(dāng)復(fù)性時(shí)，探針結(jié)合在模板上， FAM基團(tuán)和 Red640基團(tuán)相鄰，激發(fā) FAM產(chǎn)生的熒光，作為 Red640基團(tuán)的激發(fā)光被吸收，使 Red640 發(fā)出波長(zhǎng)為 640的熒光。 PCR擴(kuò)增程序通常是： 94～ 55～ 72 ℃ 三步法， 40個(gè)循環(huán)。由于是酶切作用的存在，分子信標(biāo)也是積累熒光。與模板配對(duì)后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。 分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為 1530個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般 57個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。 Taqman探針工作原理
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