熒光定量pcr技術(shù)講座(參考版)
2025-05-06 18:46本頁(yè)面
【正文】 得諾貝爾獎(jiǎng) 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司 總機(jī)： 01058851919 免費(fèi)電話： 4006222360 網(wǎng)址： Email: 。 康為世紀(jì)產(chǎn)品 RNA Trizol 超純 RNA提取試劑盒 動(dòng)物組織 RNA 植物 RNA 血液 RNA 病毒 RNA 逆轉(zhuǎn)錄 SuperRT / HiFiMMLV逆轉(zhuǎn)錄酶 cDNA第一鏈合成試劑盒 RTPCR 一步法、兩步法試劑盒 熒光定量 PCR UltraSYBR Mixture FastSYBR Mixture GoldStar Taqman Mixture PCR GoldStar DNA Polymerase Taq /Es Taq DNA Polymerase Taq /Es Taq Master Mix 外包服務(wù) ? Housekeeping gene – 引物序列？反應(yīng)條件？ ? 目標(biāo)基因 – 引物序列？反應(yīng)條件？ ? 選擇試劑，摸索條件，優(yōu)化參數(shù) – 兩個(gè)月？ CoWin解決方案一： Primer assay – 客戶指定：物種， housekeeping gene，目標(biāo)基因 – 客戶得到：經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化、驗(yàn)證過(guò)的引物，反應(yīng)條件參數(shù)， MasterMix – 客戶下游工作： Realtime PCR – 數(shù)據(jù)獲取 CoWin解決方案二：全套 qPCR服務(wù) – 客戶指定：物種， housekeeping gene，目標(biāo)基因 – 客戶提供：生物樣本 – 客戶得到：數(shù)據(jù)報(bào)告，剩余樣品。 熒光定量產(chǎn)品 染料法 FastSYBR Mixture UltraSYBR Mixture ?GoldStar Taq ?特異性強(qiáng) ?靈敏度高 ?Ct值更低 ?線性范圍更廣 ?定量更準(zhǔn)確 ?反應(yīng)速度快 ?比普通反應(yīng)可節(jié)省約 40分鐘 ?適合于普通和快速定量 PCR程序 熒光定量產(chǎn)品 染料法 某其它品牌 康為 UltraSYBR cDNA用內(nèi)參 actin引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物片段 100bp。 Housekeeping gene 反應(yīng)效率正常 ,但 目標(biāo)基因放大效率不高 PCR引物不良 重新設(shè)計(jì)引物，減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo)區(qū)段， 考慮不同剪接體 目標(biāo)基因表達(dá)豐度在 樣本之間異常一致 RNA被基因組 DNA污染 1. 使用跨 intron 引物 2. 用 DNase處理 RNA 3. 確保 RNA陰性對(duì)照表現(xiàn)陰性 溶解曲線出現(xiàn)雜峰 1. 出現(xiàn)非特異 PCR產(chǎn)物 2. 出現(xiàn)引物二聚體 1. 嘗試不同 PCR引物 2. 嘗試不同熱循程序，升高復(fù)性溫度 3. 修改儀器設(shè)置，將檢測(cè)溫度設(shè)定在在引物二聚體解鏈溫度與 PCR特異產(chǎn)物解鏈溫度之間。減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo) 區(qū)段，考慮不同剪接體。 逆轉(zhuǎn)錄效率不高 2. PCR引物不良 1. 富集 mRNA 2. 在逆轉(zhuǎn)錄中嘗試不同引物，如特異引物。 ? 需參照儀器要求選擇。 推薦：工作的成熟階段，以及多個(gè)樣本單個(gè)靶基因檢測(cè)。 一步法： 簡(jiǎn)單、靈敏度高，有效減少實(shí)驗(yàn)操作誤差和污染。 cDNA可長(zhǎng)期保留，檢測(cè)多個(gè)基因，便于反應(yīng)條件的優(yōu)化。 不同環(huán)境，不同器官、組織、細(xì)胞類(lèi)型之間，表達(dá)量相對(duì)恒定。 數(shù)據(jù)分析 qPCR cDNA total RNA 內(nèi)參基因的選擇 特點(diǎn) 選擇內(nèi)參基因 內(nèi)參基因 betaactin、 GAPDH、 18S rRNA、 28S rRNA等
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