【正文】 比較大的樣品，需重復(fù)實驗。對于和實驗預(yù)期偏離析功能，可以將結(jié)果直接轉(zhuǎn)化為各種圖表及柱狀圖。七、實驗中污染的防控七、實驗中污染的防控圖中最后一個樣品為陰性對照，本來應(yīng)該圖中最后一個樣品為陰性對照，本來應(yīng)該是一直線，但是儀器也檢測到了熒光信號是一直線，但是儀器也檢測到了熒光信號七、實驗中污染的防控七、實驗中污染的防控電泳結(jié)果顯示，該陰性對照確實有電泳結(jié)果顯示，該陰性對照確實有 PCR產(chǎn)物出現(xiàn)產(chǎn)物出現(xiàn)七、實驗中污染的防控七、實驗中污染的防控通過定量 PCR檢測，測得該陰性樣品中含有 227個初始模板。七、實驗中污染的防控七、實驗中污染的防控?zé)晒舛?、熒光定?PCR實驗中污染的防控實驗中污染的防控（（ 4）、對于未知污染源的頑固的污染的防控）、對于未知污染源的頑固的污染的防控 這類污染也經(jīng)常出現(xiàn)，找不到明確的污染源，而且此類污染又非常這類污染也經(jīng)常出現(xiàn)，找不到明確的污染源，而且此類污染又非常 頑固，對于這種情況，最好的辦法就是不去管它，在采用絕對定量頑固，對于這種情況，最好的辦法就是不去管它，在采用絕對定量 和雙標準曲線法時，污染的初始模板量可由陰性對照檢測出來，知和雙標準曲線法時，污染的初始模板量可由陰性對照檢測出來，知 道了污染的初始模板量后，我們可以把測得樣品的初始模板量減去道了污染的初始模板量后，我們可以把測得樣品的初始模板量減去 污染的初始模板量，在分析時就避免了污染造成的誤差。（（ 3）、對于樣品間的檢查污染）、對于樣品間的檢查污染 樣品間的交叉污染往往是因為高濃度的樣品在加樣室形成了氣溶樣品間的交叉污染往往是因為高濃度的樣品在加樣室形成了氣溶 膠，因為樣品的膠，因為樣品的 cDNA鏈較長，經(jīng)常開紫外燈，把長鏈鏈較長，經(jīng)常開紫外燈，把長鏈 cDNA打斷，能打斷，能 有效避免此類污染的發(fā)生，另外保持加樣室空氣流通也有助于防止有效避免此類污染的發(fā)生，另外保持加樣室空氣流通也有助于防止 此類污染。（（ 2）、對于標準品引起的污染）、對于標準品引起的污染 目前只能是以預(yù)防，加標準品時最好采用專用移液器，不要和加樣目前只能是以預(yù)防，加標準品時最好采用專用移液器，不要和加樣 的移液器交叉使用，加標準品時最好在通風(fēng)廚中進行，和加樣的操的移液器交叉使用，加標準品時最好在通風(fēng)廚中進行，和加樣的操 作臺隔離開。七、實驗中污染的防控七、實驗中污染的防控?zé)晒舛?、熒光定?PCR實驗中污染的防控實驗中污染的防控（（ 1）、對于）、對于 PCR產(chǎn)物引起的污染產(chǎn)物引起的污染 最簡單有效地辦法就是將電泳室與加樣室徹底隔離開，做到每個房最簡單有效地辦法就是將電泳室與加樣室徹底隔離開，做到每個房 間都有專屬的移液器，做到移液器專用；或者采用間都有專屬的移液器，做到移液器專用；或者采用 dU代替代替 dT配合配合 UNG酶酶 ， 是解決是解決 PCR產(chǎn)物污染的有效辦法，但是成本較高。（（ 3）、高濃度的樣品引起的污染）、高濃度的樣品引起的污染 高濃度的陽性樣品在加樣過程中可能會形成氣溶膠，造成污染。（（ 2）、標準品引起的污染）、標準品引起的污染 常用的標準品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的常用的標準品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的 PCR產(chǎn)物等，由于產(chǎn)物等，由于 標準品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的，所以在稀釋過程中，標準品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的，所以在稀釋過程中， 有可能引起污染。七、實驗中污染的防控七、實驗中污染的防控?zé)晒舛?、熒光定?PCR實驗中污染源的分析實驗中污染源的分析（（ 1）、）、 PCR產(chǎn)物引起的污染產(chǎn)物引起的污染 在檢測過程中，熒光定量在檢測過程中，熒光定量 PCR產(chǎn)物都是封閉在產(chǎn)物都是封閉在 PCR管中的，不存在開管中的，不存在開 管檢測，所以有污染的話，最有可能是因為電泳檢測熒光定量管檢測，所以有污染的話，最有可能是因為電泳檢測熒光定量 PCR 產(chǎn)物時引起的污染，只要將電泳室與產(chǎn)物時引起的污染，只要將電泳室與 PCR加樣室隔離開，就能有效加樣室隔離開，就能有效 的避免的避免 PCR產(chǎn)物的污染。如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們在擴增曲線上的在擴增曲線上的 CT值之差，應(yīng)該相等，但是后邊幾個濃度低的樣品值之差，應(yīng)該相等，但是后邊幾個濃度低的樣品 CT值明顯提值明顯提前了，由熔解曲線可知對于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴重。六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范操作規(guī)范、操作規(guī)范同一 cDNA樣品的三個重復(fù)六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范模板濃度越低，染料法的誤差越大。 同一個同一個 cDNA樣品做三個重復(fù)定量檢測求平均值主要是消除加樣時的樣品做三個重復(fù)定量檢測求平均值主要是消除加樣時的 誤差，排槍加樣時，誤差很小，加樣時的誤差可以通過設(shè)幾個重復(fù)誤差，排槍加樣時，誤差很小，加樣時的誤差可以通過設(shè)幾個重復(fù) 檢測出來。六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范操作規(guī)范、操作規(guī)范（（ 7）、重復(fù)操作）、重復(fù)操作 讓重復(fù)操作最大的修正偏差？最有意義的重復(fù)是在提取樣品讓重復(fù)操作最大的修正偏差？最有意義的重復(fù)是在提取樣品 RNA時時 就重復(fù)，同一個樣品，分別提取就重復(fù)，同一個樣品，分別提取 3份份 RNA， 3份份 RNA都做反轉(zhuǎn)錄，所都做反轉(zhuǎn)錄，所 得的得的 3份份 cDNA都做定量都做定量 PCR檢測，這樣的重復(fù)之所以最有意義是因檢測，這樣的重復(fù)之所以最有意義是因 為我們是把為我們是把 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、上機檢測三步做了重復(fù)，這樣得出提取、反轉(zhuǎn)錄、上機檢測三步做了重復(fù)，這樣得出 的平均值要比只在上機檢測時對同一的平均值要比只在上機檢測時對同一 cDNA樣品做三個重復(fù)要有意義樣品做三個重復(fù)要有意義 的多。（（ 6）、體系中最好摻入）、體系中最好摻入 ROX參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。（（ 5）、做定量）、做定量 PCR時，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到時，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到 PCR管管 中，分裝時盡量采用排槍，加樣時盡量最好采用排槍。（（ 4）、對于精度要求較高的定量）、對于精度要求較高的定量 PCR，最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做，最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達恒定基因作為內(nèi)參。（（ 3）、得到的）、得到的 RNA立即反轉(zhuǎn)錄為立即反轉(zhuǎn)錄為 cDNA， RNA樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所得得 cDNA要用看家基因檢測。六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范操作規(guī)范、操作規(guī)范（（ 2）、核酸提?。?、核酸提取 加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)要去除干凈，確保加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)要去除干凈，確保 得到高質(zhì)量的核酸，分光光度計檢測核算質(zhì)量，得到高質(zhì)量的核酸，分光光度計檢測核算質(zhì)量， RNA OD260/280＝＝ ，左右， DNA OD260/280＝＝ ，最好再做電泳檢測；同一樣左右，最好再做電泳檢測；同一樣 品要提取品要提取 2到到 3個個 RNA，所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。如測定一種藥物 到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時此藥品完全被小白到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時此藥品完全被小白 鼠攝食；選取試驗樣品時，要保證選取的組織盡可能的純，不要污鼠攝食；選取試驗樣品時，要保證選取的組織盡可能的純，不要污 染其他組織，如選取脾臟組織時，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié)染其他組織，如選取脾臟組織時，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié) 締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。（（ 1）、樣品的處理及選?。悠返奶幚砑斑x取 處理樣品時，必須確保樣品都得到了充分的處理。要想達到這個目標，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測，每一步都要規(guī)范操作。操作規(guī)范、操作規(guī)范 熒光定量熒光定量 PCR是一項對操作要求很高的實驗，同時又是花費很高的一項是一項對操作要求很高的實驗，同時又是花費很高的一項實驗，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯誤。（（ 2）、儀器設(shè)備引起的誤差）、儀器設(shè)備引起的誤差 測量標準品核酸濃度時，分光光度計的誤差，從光密度值到質(zhì)量再測量標準品核酸濃度時，分光光度計的誤差，從光密度值到質(zhì)量再 到摩爾量，誤差本身就很大（雙標準曲線法不一定非要測標準品的到摩爾量，誤差本身就很大（雙標準曲線法不一定非要測標準品的 濃度）；濃度）； 定量定量 PCR儀的誤差儀的誤差 耗材引起的誤差，耗材引起的誤差， 96空板封口膜透光性的差異等空板封口膜透光性的差異等六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范誤差分析、誤差分析（（ 3）、相對定量時內(nèi)參基因表達不穩(wěn)定引起的誤差）、相對定量時內(nèi)參基因表達不穩(wěn)定引起的誤差（（ 4）、操作引起的誤差）、操作引起的誤差 樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤 差。六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范誤差分析、誤差分析（（ 1）、實驗方案本身的誤差）、實驗方案本身的誤差 熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會引起誤差；熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會引起誤差； 2 △△△△ CT法由于也是一種近似的算法，所以不可避免的也會引起法由于也是一種近似的算法，所以不可避免的也會引起 誤差；誤差； Taqman探針法誤差相對較??；探針法誤差相對較?。? 雙標準曲線法誤差相對較小。 根據(jù)實驗的實際情況，如檢測的精度要求、樣品數(shù)量、基因數(shù)量、根據(jù)實驗的實際情況，如檢測的精度要求、樣品數(shù)量、基因數(shù)量、經(jīng)費情況等來選擇合適的實驗方案。（（ 4）、）、 2 △△△△ CT法適合檢測精度要求一般，樣品量相對較少，檢測的基法適合檢測精度要求一般，樣品量相對較少，檢測的基 因種類相對較多的實驗。（（ 3）、雙標準曲線法適合樣品量大、檢測的基因種類相對較少、精度