【正文】 ，同一個(gè)樣品，分別提取 3份份 RNA， 3份份 RNA都做反轉(zhuǎn)錄，所都做反轉(zhuǎn)錄，所 得的得的 3份份 cDNA都做定量都做定量 PCR檢測，這樣的重復(fù)之所以最有意義是因檢測，這樣的重復(fù)之所以最有意義是因 為我們是把為我們是把 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、上機(jī)檢測三步做了重復(fù)，這樣得出提取、反轉(zhuǎn)錄、上機(jī)檢測三步做了重復(fù)，這樣得出 的平均值要比只在上機(jī)檢測時(shí)對同一的平均值要比只在上機(jī)檢測時(shí)對同一 cDNA樣品做三個(gè)重復(fù)要有意義樣品做三個(gè)重復(fù)要有意義 的多。（（ 5）、做定量）、做定量 PCR時(shí)，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到時(shí)，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到 PCR管管 中，分裝時(shí)盡量采用排槍，加樣時(shí)盡量最好采用排槍。（（ 3）、得到的）、得到的 RNA立即反轉(zhuǎn)錄為立即反轉(zhuǎn)錄為 cDNA， RNA樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所得得 cDNA要用看家基因檢測。如測定一種藥物 到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時(shí)此藥品完全被小白到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時(shí)此藥品完全被小白 鼠攝食；選取試驗(yàn)樣品時(shí)，要保證選取的組織盡可能的純，不要污鼠攝食；選取試驗(yàn)樣品時(shí)，要保證選取的組織盡可能的純，不要污 染其他組織，如選取脾臟組織時(shí)，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié)染其他組織，如選取脾臟組織時(shí)，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié) 締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。要想達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測，每一步都要規(guī)范操作。（（ 2）、儀器設(shè)備引起的誤差）、儀器設(shè)備引起的誤差 測量標(biāo)準(zhǔn)品核酸濃度時(shí)，分光光度計(jì)的誤差，從光密度值到質(zhì)量再測量標(biāo)準(zhǔn)品核酸濃度時(shí)，分光光度計(jì)的誤差，從光密度值到質(zhì)量再 到摩爾量，誤差本身就很大（雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法不一定非要測標(biāo)準(zhǔn)品的到摩爾量，誤差本身就很大（雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法不一定非要測標(biāo)準(zhǔn)品的 濃度）；濃度）； 定量定量 PCR儀的誤差儀的誤差 耗材引起的誤差，耗材引起的誤差， 96空板封口膜透光性的差異等空板封口膜透光性的差異等六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范誤差分析、誤差分析（（ 3）、相對定量時(shí)內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差）、相對定量時(shí)內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差（（ 4）、操作引起的誤差）、操作引起的誤差 樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤 差。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，如檢測的精度要求、樣品數(shù)量、基因數(shù)量、根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，如檢測的精度要求、樣品數(shù)量、基因數(shù)量、經(jīng)費(fèi)情況等來選擇合適的實(shí)驗(yàn)方案。（（ 3）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法適合樣品量大、檢測的基因種類相對較少、精度要求）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法適合樣品量大、檢測的基因種類相對較少、精度要求 較高的實(shí)驗(yàn)。四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化自行配制熒光定量、自行配制熒光定量 PCR試劑試劑（（ 1）、常用的）、常用的 SYBR GreenⅠⅠ 預(yù)混酶預(yù)混酶 （（ 2X）） HotStar TaqE ＋＋ Buffer ＋＋ Mg2 其中其中 Mg2＋濃度為＋濃度為 6～～ 7mM（（ 2）、常用的）、常用的 Taqman預(yù)混酶（預(yù)混酶（ 2X）） TaqE ＋＋ Buffer ＋＋ Mg2 其中其中 Mg2＋濃度為＋濃度為 10mM五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇定量 PCR實(shí)驗(yàn)方案定量 PCR實(shí)驗(yàn)方案熒光染料法Taqman探針法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2 △△△△ CT法法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2 △△△△ CT法法五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇定量 PCR實(shí)驗(yàn)方案（（ 1）、染料法適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；在分析）、染料法適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；在分析 的基因種類很多，但是樣品量很少時(shí)，尤其適用。普通普通 PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 模板模板 引物引物 Taq酶酶 Buffer Mg2＋＋ 水水定量 PCR反應(yīng)體系 模板模板 引物引物 熒光基團(tuán)熒光基團(tuán) Taq酶酶 Buffer Mg2＋＋ 水水四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系、為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系普通 PCR結(jié)果電泳圖 添加熒光基團(tuán)后 PCR結(jié)果電泳圖四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化如何優(yōu)化、如何優(yōu)化 由上圖可知，添加熒光基團(tuán)后，由上圖可知，添加熒光基團(tuán)后， PCR的反應(yīng)效率幾乎為的反應(yīng)效率幾乎為 0，所以必須對，所以必須對熒光定量熒光定量 PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，對體系中各個(gè)反應(yīng)成分的濃度進(jìn)行調(diào)整。 對于比較精確的實(shí)驗(yàn)，最好采用兩種或兩種以上表達(dá)穩(wěn)定的基因作為對于比較精確的實(shí)驗(yàn)，最好采用兩種或兩種以上表達(dá)穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參，對每種內(nèi)參基因測得的基因表達(dá)變化求方差和平均值。三、內(nèi)參基因的選擇三、內(nèi)參基因的選擇內(nèi)參基因的選擇策略、內(nèi)參基因的選擇策略 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，不同組織、不同細(xì)胞、細(xì)胞的不同生理時(shí)期、根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，不同組織、不同細(xì)胞、細(xì)胞的不同生理時(shí)期、不同的理化條件刺激等，查閱相關(guān)資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做不同的理化條件刺激等，查閱相關(guān)資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做熒光定量熒光定量 PCR，先以，先以 CT值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與其其相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說明該基因相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說明該基因表達(dá)穩(wěn)定，適合作為理想的內(nèi)參。（（ 2）、）、 βactin 當(dāng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，當(dāng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化時(shí)， βactin mRNA的表達(dá)水平增加。三、內(nèi)參基因的選擇三、內(nèi)參基因的選擇常用內(nèi)參基因的表達(dá)情況、常用內(nèi)參基因的表達(dá)情況（（ 1）、）、 GAPDH GAPDH mRNA在不同癌組織在不同癌組織 (包括肺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌等包括肺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌等 )中的表達(dá)中的表達(dá)升高，在不同個(gè)體間、懷孕期間以及細(xì)胞周期的不同階段等變化很大，在升高，在不同個(gè)體間、懷孕期間以及細(xì)胞周期的不同階段等變化很大，在正常的結(jié)腸上皮、人類前列腺癌的細(xì)胞周期不同階段也呈現(xiàn)出顯著性變正常的結(jié)腸上皮、人類前列腺癌的細(xì)胞周期不同階段也呈現(xiàn)出顯著性變化。 理想的內(nèi)參基因很少或者說不存在，因?yàn)樗谢蛟诓煌募?xì)胞或組理想的內(nèi)參基因很少或者說不存在，因?yàn)樗谢蛟诓煌募?xì)胞或組織中、在細(xì)胞的不同生理時(shí)期、在不同的理化等外界刺激下，其表達(dá)量都織中、在細(xì)胞的不同生理時(shí)期、在不同的理化等外界刺激下，其表達(dá)量都會(huì)有所差異，會(huì)有所差異， 有時(shí)可以是幾倍、幾十倍甚至是上百倍的差異。 95℃℃ ， 20s， 60℃℃ ， 20s， 40個(gè)個(gè) cycles；看熒光本底和；看熒光本底和 熒光強(qiáng)度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著熒光強(qiáng)度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著 PCR反應(yīng)，熒反應(yīng)，熒 光強(qiáng)度不會(huì)變化，假如熒光強(qiáng)度變化的比較大，說明探針合成質(zhì)量光強(qiáng)度不會(huì)變化，假如熒光強(qiáng)度變化的比較大，說明探針合成質(zhì)量 較差，建議重新合成。左右。 該方法特別適合于樣品量不大，但是檢測的基因種類很多的情況。）、該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實(shí)驗(yàn)。法。常用的內(nèi)參基因是在各種生理?xiàng)l件下表達(dá)量恒定的基因，這些基的差異。曲同工之處。核酸雙鏈的值。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR線性關(guān)系成立的條件分析線性關(guān)系成立的條件分析左圖橫坐標(biāo)是左圖橫坐標(biāo)是 PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度 Rn，改圖反映的是各個(gè)樣品隨，改圖反映的是各個(gè)樣品隨著每輪著每輪 PCR反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時(shí)變化；右圖橫坐標(biāo)也是反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時(shí)變化；右圖橫坐標(biāo)也是 PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值是總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值 RT –RB即即 △△ Rn的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直線上所有樣品的直線上所有樣品的 RT –RB的對數(shù)都相同，熒光定量的對數(shù)都相同，熒光定量 PCR的線性關(guān)系才會(huì)成立。 RT= RB+ X0(1+ E) Rs lg(RT RB) = lgX0 + CT lg(1+ E) + lg Rs CT lg(1+ E) = lgX0 + lg(RT RB) –lg Rs 此時(shí)，此時(shí)， PCR反應(yīng)處于指數(shù)期階段，所有樣品的反應(yīng)效率反應(yīng)處于指數(shù)期階段，所有樣品的反應(yīng)效率 E穩(wěn)定且近似相穩(wěn)定且近似相等；等； lg(RT RB)、 Rs也都相同，只有也都相同，只有 CT值和值和 lgX0為變量，且這兩個(gè)變?yōu)樽兞?，且這兩個(gè)變量之間成一次性方程。反應(yīng)的效率。其共同性質(zhì)為：等。酶就能滿足實(shí)驗(yàn)的要求。時(shí)常常被采用。等。理想的熒光物質(zhì)需具備以下特點(diǎn)：點(diǎn)： （（ 1）、本底低）、本底低（（ 2）、熒光強(qiáng)度高）、熒光強(qiáng)度高（（ 3）、每輪）、每輪 PCR反應(yīng)完成后都有熒光強(qiáng)度的增高，而且這種熒反應(yīng)完成后都有熒光強(qiáng)度的增高，而且這種熒 光強(qiáng)度的增高和每輪循環(huán)后光強(qiáng)度的增高和每輪循環(huán)后 PCR產(chǎn)物的量成線性關(guān)系產(chǎn)物的量成線性關(guān)系（（ 4）、沒有）、沒有 PCR產(chǎn)物時(shí)，沒有熒光產(chǎn)物時(shí)，沒有熒光（（ 5）、該熒光物質(zhì)的受激發(fā)后其發(fā)射光的波長范圍窄，各種）、該熒光物質(zhì)的受激發(fā)后其發(fā)射光的波長范圍窄，各種 熒光不會(huì)產(chǎn)生熒光的交叉干擾熒光不會(huì)產(chǎn)生熒光的交叉干擾一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量、熒光定量 PCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)目前常用的幾種熒光物質(zhì)目前常用的幾種熒光物質(zhì)（（ 1）、）、 Taqman探針類探針類5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，端標(biāo)記熒光基團(tuán)， 3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，沒有端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，沒有熒光，探針斷裂后，在激發(fā)光的作用下，熒光基團(tuán)產(chǎn)生熒光熒光，探針斷裂后，在激發(fā)光的作用下，熒光基團(tuán)產(chǎn)生熒光；；探針本身序列與目的基因序列互補(bǔ)，特異性高，退火后探針探針本身序列與目的基因序列互補(bǔ)