【正文】 擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯時，為避免基因組的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯 子；子；（（ 4）、引物之間的）、引物之間的 TM相差避免超過相差避免超過 2℃℃ ；；（（ 5）、典型的引物）、典型的引物 18到到 24個核苷長；個核苷長；（（ 6）、目的基因和內(nèi)參基因所擴增的）、目的基因和內(nèi)參基因所擴增的 PCR產(chǎn)物長度盡量一致，不大于產(chǎn)物長度盡量一致，不大于 300bp，這樣有利于使兩種基因，這樣有利于使兩種基因 PCR效率相同效率相同（（ 7）、將設(shè)計好的引物用序列分析軟件分析其二級結(jié)構(gòu)并做）、將設(shè)計好的引物用序列分析軟件分析其二級結(jié)構(gòu)并做 BLAST分析其分析其 特異性特異性 二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計探針的設(shè)計 Taqman探針及引物的設(shè)計原則探針及引物的設(shè)計原則 ：： 在在 Taqman探針法中，探針法中， Taq酶除了酶除了 5’3’聚合酶作用之外，還要聚合酶作用之外，還要 5’3’外切酶外切酶的活性來切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，普通的活性來切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，普通 PCR的延伸溫度為的延伸溫度為 72℃℃ ，此溫度為，此溫度為 Taq酶聚合作用的最佳溫度；酶聚合作用的最佳溫度； Taqman探針法反應(yīng)中，在要求探針法反應(yīng)中，在要求 Taq酶酶 5’3’聚合酶聚合酶活活性的同時，還需要性的同時，還需要 Taq酶酶 5’3’外切酶的活性來切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，外切酶的活性來切斷探針鏈產(chǎn)生熒光， Taq酶酶5’3’外切酶活性的最佳溫度為外切酶活性的最佳溫度為 60℃℃ ，所以，所以 Taqman PCR反應(yīng)的一般采用兩步反應(yīng)的一般采用兩步法，即法，即 95℃℃ 變性，變性， 60℃℃ 復(fù)性延伸。 在在 Taqman探針及引物的設(shè)計過程中，引物的探針及引物的設(shè)計過程中，引物的 TM值已經(jīng)確定為值已經(jīng)確定為 60℃℃ 左左右，在每輪右，在每輪 PCR循環(huán)的復(fù)性過程中（循環(huán)的復(fù)性過程中（ 95→→ 60℃℃ ），為了確保探針先于引物），為了確保探針先于引物與與模板結(jié)合，這就要求探針的模板結(jié)合，這就要求探針的 TM值高于引物值高于引物 10℃℃ 左右，所以左右，所以 Taqman探針及探針及引引物一般都是引物物一般都是引物 TM值為值為 60℃℃ 左右，探針的左右，探針的 TM值為值為 70℃℃ 左右。二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計探針的設(shè)計 Taqman探針及引物的設(shè)計原則探針及引物的設(shè)計原則 ：：（（ 1）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（（ 2）、檢測）、檢測 mRNA時，為避免基因組的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯時，為避免基因組的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯 子；子；（（ 3）、引物）、引物 TM值為值為 60℃℃ 左右，探針的左右，探針的 TM值為值為 70℃℃ 左右；左右；（（ 4）、探針的）、探針的 5’端應(yīng)避免使用鳥嘌呤端應(yīng)避免使用鳥嘌呤 G，因為，因為 5’G會有淬滅作用，而且即使會有淬滅作用，而且即使 是被切割下來還會存在淬滅作用；是被切割下來還會存在淬滅作用； （（ 5）、整條探針中，堿基）、整條探針中，堿基 C的含量要明顯高于的含量要明顯高于 G的含量的含量 G含量高會降低反應(yīng)含量高會降低反應(yīng) 效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針；效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針； （（ 6）、引物之間的）、引物之間的 TM相差避免超過相差避免超過 2℃℃ ；；（（ 7）、典型的引物長度為）、典型的引物長度為 1824bp，探針長度為，探針長度為 1545bp；；（（ 8）、）、 PCR產(chǎn)物長度在產(chǎn)物長度在 50150bp之間，這樣有利于使之間，這樣有利于使 PCR效率相同；效率相同；（（ 9）、將設(shè)計好的引物用序列分析軟件分析其二級結(jié)構(gòu)并做）、將設(shè)計好的引物用序列分析軟件分析其二級結(jié)構(gòu)并做 BLAST分析其分析其 特異性特異性 二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計探針的設(shè)計 Taqman探針及引物的設(shè)計原則探針及引物的設(shè)計原則 ：：探針中 GC含量的差異對定量 PCR反應(yīng)效率的影響二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計探針的設(shè)計 Taqman探針及引物的設(shè)計舉例探針及引物的設(shè)計舉例 1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC181 AGGGAGAAAG TGGTTGACAT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG TAGATTTGCA CATGAAGCTA241 GGAGACAATG GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGATA ACAATCAGGA GGTAATTCCT301 TATCATCTGT CTACGTCCCC CATCCTGTCT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTG361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC CTGGACAGCA GTGTATCTTC ACAAGTACCA421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA481 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC CACAAAATAG ACAGCTTAAA AAGAGAAGAC541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC AGAGGAAGAA601 AAGGAACAAT TGGACAATTC AAGGATTCTT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCT661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT721 GGAGAATGGT CACCCATTCA AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC經(jīng)經(jīng) Oligo軟件驗證，探針軟件驗證，探針 TM值值 70℃℃ 左右，左右， 上下游引物的上下游引物的 TM值都為值都為 60 ℃℃ 左右，二級結(jié)構(gòu)左右，二級結(jié)構(gòu)分析，引物和探針比較理想，再經(jīng)分析，引物和探針比較理想，再經(jīng) BLAST分析，引物和探針特異性較好。二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計探針的設(shè)計 Taqman探針及引物合成時注意事項探針及引物合成時注意事項（（ 1）、引物及探針設(shè)計好之后，委托一家放心的合成公司合成；）、引物及探針設(shè)計好之后，委托一家放心的合成公司合成；（（ 2）、先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通）、先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，電泳檢測，電泳檢測 PCR產(chǎn)物，看是否和設(shè)計的長度吻合，再看看非特異產(chǎn)物，看是否和設(shè)計的長度吻合，再看看非特異 性擴增情況，必要時進(jìn)行性擴增情況，必要時進(jìn)行 PCR產(chǎn)物的測序驗證；產(chǎn)物的測序驗證；（（ 3）、確定引物沒有問題后，再將探針?biāo)徒缓铣桑@樣安排能避免很多以）、確定引物沒有問題后，再將探針?biāo)徒缓铣桑@樣安排能避免很多以 外的損失；外的損失；（（ 4）、探針合成好后，先檢測一下探針的質(zhì)量，）、探針合成好后，先檢測一下探針的質(zhì)量， 250nm的探針終濃度，的探針終濃度， 25ul水，反應(yīng)體系中只有水和探針，在熒光定量水，反應(yīng)體系中只有水和探針，在熒光定量 PCR儀上檢測，儀上檢測， 95℃℃ ， 2min。較差，建議重新合成。影響。盲目地使用有時可以是幾倍、幾十倍甚至是上百倍的差異。一方面可能引致錯誤甚至相反的結(jié)論。在各種因素化。的表達(dá)水平也不同。的表達(dá)水平增加。表達(dá)量顯著上調(diào)。表達(dá)穩(wěn)定，適合作為理想的內(nèi)參。內(nèi)參分析軟件來選擇合適的內(nèi)參基因。內(nèi)參，對每種內(nèi)參基因測得的基因表達(dá)變化求方差和平均值。的反應(yīng)效率。反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，對體系中各個反應(yīng)成分的濃度進(jìn)行調(diào)整。四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化如何優(yōu)化、如何優(yōu)化SYBR GreenⅠⅠ 反應(yīng)體系中反應(yīng)體系中 Mg2＋濃度梯度優(yōu)化＋濃度梯度優(yōu)化 PCR電泳結(jié)果電泳結(jié)果四、反應(yīng)體系的優(yōu)化四、反應(yīng)體系的優(yōu)化如何優(yōu)化、如何優(yōu)化優(yōu)化后的 Taqman探針體系實驗結(jié)果， Mg2＋濃度為＋濃度為，引物濃度為左右，引物濃度為 500nM，探針濃度為，探針濃度為 250nM。的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。倍的變化）。較高的實驗。因種類相對較多的實驗。經(jīng)費情況等來選擇合適的實驗方案。雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法誤差相對較小。差。要想達(dá)到這個目實驗，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯誤。標(biāo)，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測，每一步都要規(guī)范操作。如測定一種藥物處理樣品時，必須確保樣品都得到了充分的處理。締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。要用看家基因檢測。內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達(dá)恒定基因作為內(nèi)參。中，分裝時盡量采用排槍，加樣時盡量最好采用排槍。參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。的多。檢測出來。如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們模板濃度越低，染料法的誤差越大。前了，由熔解曲線可知對于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。產(chǎn)物的污染。有可能引起污染。高濃度的陽性樣品在加樣過程中可能會形成氣溶膠，造成污染。產(chǎn)物污染的有效辦法，但是成本較高。作臺隔離開。此類污染。污染的初始模板量，在分析時就避免了污染造成的誤差。假如這個污染屬于是頑固的未知污染，可以用正常樣品測得的初始模板量減去 227，來避免污染引起的誤差八、實驗結(jié)果的分析八、實驗結(jié)果的分析 實驗結(jié)束后將得到的結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)在很多軟件都帶有結(jié)果的自動分實驗結(jié)束后將得到的結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)在很多軟件都帶有結(jié)果的自動分析功能，可以將結(jié)果直接轉(zhuǎn)化為各種圖表及柱狀圖。對于和實驗預(yù)期偏離比較大的樣品，需重復(fù)實驗。謝 謝！電話： 15238020968， ： 458261751，都市巡洋艦如有問題需要交流，請隨時聯(lián)系 ！