【正文】 TaKaRa設(shè)計 Real Time PCR用引物探針特點 對登錄在 NCBI RefSeq上的 Mouse? Rat? Human的mRNA序列已全部設(shè)計完成 (SYBR法 ) Real Time PCR用引物設(shè)計合成服務(wù) 生物秀 — 專心做生物！ 內(nèi)含子大小 全序列中內(nèi)含子數(shù)目 點擊進入 UCSC網(wǎng)站 內(nèi)含子大小 全序列中內(nèi)含子數(shù)目 點擊進入 UCS 網(wǎng)站 引物詳細資料 Real Time PCR用引物設(shè)計合成服務(wù) 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR檢測技術(shù)服務(wù) TaKaRa Real Time PCR檢測技術(shù)服務(wù)包括從引物探針設(shè)計合成到 Real Time PCR反應(yīng)性確認以及樣品檢測、解析的全套服務(wù)。 引物序列不含有已知的 SNP位點 (已在 dbSNP上登錄 ) 通過同源性檢索確認了其特異性。 不易形成引物二聚體。 與 Perfect Real Time系列試劑配套使用效果最佳。 Premix Ex TaqTM（ Perfect Real Time） TaKaRa CodeDRR041 以及 A、 B、 C、 D公司同類試劑 實驗項目 以 λDNA （ 1fg、 10fg、 100fg、 1pg、 10pg、 100pg、 1ng）為模板， 進行 300bp擴增性能及擴增特異性檢測。 試劑名稱 SYBR174。 ? 價格因素 → 降低實驗成本。 ? 高反應(yīng)特異性 → 可在寬廣范圍內(nèi)進行準確定量 。 ExScriptTM RTPCR Kit（ Perfect Real Time） TaKaRa Code 儀 器 LineGene33 相對定量應(yīng)用實例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時間點表達量變化 生物秀 — 專心做生物！ 樣品處理 樣品數(shù) 目的基因 管家基因 藥物處理前 2 X GAPDH 藥物處理 3小時 2 藥物處理 6小時 2 藥物處理 9小時 2 藥物處理 12小時 2 樣 品 相對定量應(yīng)用實例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時間點表達量變化 生物秀 — 專心做生物！ Total RNA提取 Total RNA基因組 DNA去除 標準品 RNA制備 標準曲線制作及預(yù)實驗 詳細的實驗資料獲取 實驗設(shè)計及引物 設(shè)計、合成 樣品 Real Time PCR反應(yīng) 相對定量計算 及數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)整理及論文撰寫 相對定量應(yīng)用實例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時間點表達量變化 生物秀 — 專心做生物！ 提取 Total RNA去除基因組 DNA后電泳照片 對照組 3hr處理 6hr處理 9hr處理 12hr處理 RNA純度： 260/280 提取試劑： TaKaRa RNAiso Reagent TaKaRa Code D312 基因組 DNA去除試劑： DNase I(RNase Free) TaKaRa Code D2215 相對定量應(yīng)用實例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時間點表達量變化 生物秀 — 專心做生物！ 構(gòu)建 RNA標準品電泳照片 M GAPDH X基因 TaKaRa in Vitro Transcription T7 Kit (TaKaRa Code D6140) 相對定量應(yīng)用實例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時間點表達量變化 生物秀 — 專心做生物！ 目的基因標準曲線制作結(jié)果 擴增曲線圖 融解曲線圖 標準曲線圖 管家基因標準曲線制作結(jié)果 相對定量應(yīng)用實例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時間點表達量變化 生物秀 — 專心做生物！ 樣品目的基因定量結(jié)果 擴增曲線圖 融解曲線圖 樣品管家基因定量結(jié)果 相對定量應(yīng)用實例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時間點表達量變化 目的基因 X 管家基因 H 已知量 Ct 定量結(jié)果 已知量 Ct 定量結(jié)果 標準品 1 10 1 標準品 2 100 10 標準品 3 1000 100 標準品 3 10000 1000 標準品 5 100000 10000 Sample1(空白） 353 41300 360 39500 Sample2(空白 ) 329 43800 305 41800 Sample3(3hr) 373 40900 393 38900 Sample4(3hr) 384 42700 396 43100 Sample5(6hr) 1670 44000 1600 45400 Sample6(6hr) 1570 38900 1570 38000 Sample7(9hr) 407 41600 328 40900 Sample8(9hr) 413 46700 419 43100 Sample9(12hr) 444 41600 474 41600 Sample10(12hr) 445 38900 471 38000 相對定量應(yīng)用實例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時間點表達量變化 生物秀 — 專心做生物！ 檢測樣品 管家基因 H 目的基因 X 定量結(jié)果平均值 定量結(jié)果平均值 校正值 相對量 Sample1(空白） 40400 1 Sample2(空白） 42800 317 Sample3(3hr） 39900 383 Sample4(3hr） 42900 390 Sample5(6hr） 44700 1635 Sample6(6hr） 38450 1570 Sample7(9hr） 44700 Sample8(9hr） 44900 416 Sample9(12hr） 41600 459 Sample10(12h） 38450 458 由以上結(jié)果顯示小鼠某基因經(jīng)藥物處理 6小時時表達量最高 小鼠某基因藥物處理不同時間點表達量圖表3210123管家基因 目的基因X相對表達量（Log2）對照樣品Sample 3（3hr）Sample 4（3hr）Sample 5（6hr）Sample 6（6hr）Sample 7（9hr）Sample 8（9hr）Sample 9（12hr）Sample 10（12hr）相對定量應(yīng)用實例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時間點表達量變化 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識 Real Time PCR 實驗方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 應(yīng)用實例 Real Time PCR 相關(guān)試劑與服務(wù) 主要內(nèi)容 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 相關(guān)試劑的選擇 試劑選擇的要素 TaKaRa Perfect Real Time相關(guān)試劑在各種儀器上的適用性 TaKaRa Perfect Real Time相關(guān)試劑與其它公司同類產(chǎn)品的比較 TaKaRa Perfect Real Time相關(guān)系列產(chǎn)品特點 TaKaRa Real Time相關(guān)試劑的選擇 生物秀 — 專心做生物！ ? 使用方便性 → 2 Premix type，無需反應(yīng)條件摸索 。 利用 Cycleave法的 SNP解析原理 ROX熒光 ROX熒光 FAM熒光 FAM熒光 FAM熒光 ROX熒光 Wild homo hetero Mutant homo SNP point 定性分析應(yīng)用例 對人的 ALDH2基因進行 SNP解析 Cycling Probe法 PCRRFLP法 ROX FAM ROX、 FAM通道均有信號檢出 Eco57 I CTGAAG(N)16 GACTTC(N)14 wild type :切斷 Mutant type :不切斷 ROX FAM Mutant wild ROX通道有信號檢出 FAM 通道檢出熒光信號 ROX FAM Mutant wild Mutant wild 雜合型 (hetero) 野生型 (wild homo) 突變型 (mutant homo) 生物秀 — 專心做生物！ 提取樣品 引物、探針設(shè)計 Real Time PCR反應(yīng) 數(shù)據(jù)分析 流 程 定性分析應(yīng)用例 對人的 ALDH2基因進行 SNP解析 生物秀 — 專心做生物！ 從人血液中（共計 10個樣品）提取基因組 DNA 實驗樣品 提取試劑： Blood Genome DNA Extraction Kit (TaKaRa ) 定性分析應(yīng)用例 對人的 ALDH2基因進行 SNP解析 生物秀 — 專心做生物！ 實驗結(jié)果 定性分析應(yīng)用例 對人的 ALDH2基因進行 SNP解析 雜合型 突變型 Sample Sample2: 雜合型 (ROX, FAM 同時檢出） Sample6: 突變型（只有 FAM檢出） 其它 Sample: 野生型（只有 ROX檢出） 生物秀 — 專心做生物！ FAM ROX FAM ROX FAM ROX Sample Sample2 同時檢出 ROX、 FAM Sample6只檢出 FAM Sample3 710 只檢出 ROX 雜合型 突變型 野生型 定性分析應(yīng)用例 對人的 ALDH2基因進行 SNP解析 生物秀 — 專心做生物！ 絕對定量應(yīng)用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進行定量 檢測方法 Taq ManTM probe 法 檢測樣品 3個從 SARS病毒培養(yǎng)液中提取的 genome RNA 目的基因 SARS病毒 RNA 內(nèi) 參 SARS Internal Control RNA 標 準 品 SARS Control RNA 試 劑 One Step RTPCR Kit（ Perfect Real Time） TaKaRa 儀 器 Smart Cycler Ⅱ 生物秀 — 專心做生物！ SYN247 F02 SYN247R03 SYN247 F01 SYN247R02 SYN247R02 Bam HⅠ Hind Ⅲ pBluescript II SK(+) vector T7 promoter Bam HⅠ Hind Ⅲ SacⅠsite SARS Control RNA構(gòu)建 絕對定量應(yīng)用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進行定量 生物秀 — 專心做生物！ 絕對定量應(yīng)用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進行定量 純化的 SARS Control RNA OD值測定結(jié)果 體外轉(zhuǎn)錄的 SARS Control RNA 電泳照片 M1 M2 M1: ?Hind Ⅲ digest M2: DL2022 Marker DNase I 處理前 DNase I 處理后 生物秀 — 專心做生物！ ?DNA BNITMSARAs2 Adaptor R SacⅠsite BamHⅠsite BNITMSARS1 Adaptor F T7 promoter SARS Internal Control RNA的構(gòu)建 絕對定量應(yīng)用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RN