熒光定量pcr(編輯修改稿)
2025-08-28 14:01 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 量 PCR使用外標(biāo)定量的原因： A、內(nèi)標(biāo)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的影響 若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則 PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重 PCR，雙重 PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無(wú)法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。 B、熒光定量 PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)定量 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的： （ 1） Ct值的高度重現(xiàn)性 PCR循環(huán)在到達(dá) Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此 Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的 Ct值是恒定的。 （ 2） Ct值與起始模板的線(xiàn)性關(guān)系 由于 Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量的方法。 六、 熒光定量 PCR的分類(lèi) 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 包括探針類(lèi)和染料類(lèi)兩種 , 探針類(lèi)是利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。染料類(lèi)如SYBR Green I則是利用與雙鏈 DNA 小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。 雙鏈 DNA(dsDNA)結(jié)合染料 （ 1）、 Sybr Green I 檢測(cè)模式 SYBR Green I 是一種能與雙鏈 DNA 結(jié)合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈 DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此， SYBR Green I的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈 DNA的數(shù)量有關(guān)，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出 PCR體系存在的雙鏈 DNA數(shù)量。 SYBR Green I 的最大吸收波長(zhǎng)約為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為 520nm。 PCR擴(kuò)增程序一般為 94℃ ～ 55℃ ～ 72℃ 三步法， 40個(gè)循環(huán)。 SYBR Green I 的缺點(diǎn)： 由于 SYBR Green I沒(méi)有特異性，不能識(shí)別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會(huì)結(jié)合發(fā)光，對(duì) PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會(huì)產(chǎn)生熒光，通常本底較高，所以在臨床上使用可能會(huì)有假陽(yáng)性發(fā)生。 SYBR Green I的優(yōu)點(diǎn)： SYBR Green I的優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)槠淙秉c(diǎn)產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈 DNA相結(jié)合，所以對(duì)不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性較好，并且價(jià)格相對(duì)較低。這對(duì)科研是很有利的，因此國(guó)內(nèi)外在科研中使用比較普遍。 SYBR GREEN I 工作原理 （ 2）、 LC Green TM I 與 SYBRGreen I相比 , 該染料是一種飽和結(jié)合染料 , 能夠完全結(jié)合 dsDNA分子 ,可直接加入PCR反應(yīng)體系中 ,高濃度的 LC Green TM I不會(huì)抑制 PCR反應(yīng)。已有文獻(xiàn)報(bào)道在 PCR反應(yīng)體系中加入 LC Green TM I, 使用一對(duì)引物 , 一個(gè)不作標(biāo)記的探針 , 結(jié)合常規(guī)融解曲線(xiàn)或僅使用一對(duì)引物 , PCR 結(jié)束后通過(guò)分析融解曲線(xiàn)的形狀和融解溫度 (Tm值 )的大小 , 對(duì)純合子和雜合子以及寡核苷酸序列多態(tài)性 (SNP)進(jìn)行鑒別。 LC Green TM I染料法簡(jiǎn)便、快速、精確性高 , 預(yù)期將會(huì)有很好的應(yīng)用前景。（趙煥英等， 2022） 熒光標(biāo)記探針 （ 1）、 水解探針模式（ Taqman） TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的 5， 末端，而淬滅劑則在3， 末端。當(dāng)探針與靶序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與 3， 端的淬滅劑接近而被淬滅。在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的 5， 外切酶活性將探針切斷，使得熒光基因與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。
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